이 프로토콜은 결핵을 연구하기 위하여 대체 감염 모형으로 Galleria mellonella의 사용을 기술합니다, 연구에 사용된 포유류 모형의 수를 감소시킵니다. 쥐와 같은 기존의 포유류 모델과 비교할 때, 갤러리아 멜로넬라는 결핵을 연구하기 위해 저렴하고 윤리적으로 허용되며 접근 하기 쉬운 모델입니다. 이 모델의 추가 최적화는 후보 항균균 약물 효능 및 독성의 검사를 허용하고 결핵에 대한 긴급하게 필요한 새로운 치료법의 개발에 기여할 것이다.
갤러리아 멜로넬라는 포유류에 필적하는 복잡한 타고난 면역 체계를 가지고 있습니다. 숙주 병원체 상호 작용의 연구 결과는 결핵에 있는 타고난 면역의 역할을 더 드러낼 수 있습니다. 감염 모형으로 갤러리아 mellonella의 사용은 결핵에 국한되지 않으며 지난 10 년간 그밖 세균성 및 곰팡이 병원체를 위해 널리 이용되었습니다.
우선, 얼어 붙은 1.2 밀리리터 글리세롤 주식인 마이코박테리움 보비스 BCG 럭스, 몬트리올 백신 균주는 luxAB 유전자를 운반하는 셔틀 플라스미드 pSMT1로 변형되었다. 250 밀리리터 에를렌마이어 플라스크로 표시되어 BCG 럭스의 해동 된 1.2 밀리리터 알리쿼트미들브룩 7H9 국물의 15 밀리리터를 접종했습니다. 플라스크를 밀봉된 생물 안전 용기에 넣고 72시간 동안 220rpm의 궤도 셰이커 인큐베이터에 섭씨 37도에 배양합니다.
인큐베이션 후, 광미미터 튜브, 소용돌이에서 인산염 완충식식염으로 배양의 1:10 희석을 준비하고 발광계에 발광계관을 적재한다. 기판 1%n-데실 알데히드를 절대 에탄올에 주입기 플랫폼에 적재하고 생체 발광을 측정합니다. 생물 발광을 식민지 형성 단위로 변환하여 BCG 럭스 문화의 성장을 확인하십시오.
배양기를 원심분리기 튜브및 원심분리기로 2, 175배 g에서 실온에서 10분간 전달하여 세포를 펠릿합니다. 알려진 진균작용 활성을 가진 적당한 소독제로 상체를 버리십시오. 세균 응집을 방지하기 위해 10 분 동안 2, 175 배 g에서 원심분리하여 PBS-T의 50 밀리리터에서 세포 펠릿을 두 번 세척하십시오.
최종 세척후, 폐수제를 염수하고 PBS-T의 필요한 부피에서 균균 세포 펠릿을 재연하여 균질 현탁액을 원하는 세포 밀도로 희석시 한다. 그런 다음 PBS-T를 사용하여 24웰 플레이트에서 접종의 10배 연속 희석을 준비합니다. 접종 CFU 수를 열거하기 위해 미들브룩 7H11 천판에 각 희석제 10마이크로리터를 복제하여 복제합니다.
구입 한 인스타 애벌레는 도착 시 섭씨 18도에서 어둠 속에서 유지하고 구매 후 1 주일 이내에 사용하십시오. 균일한 크림 색, 적절한 크기와 무게, 높은 운동성, 그리고 뒤집을 때 올바른 능력을 가진 실험을 위해 건강한 애벌레를 식별하고 선택합니다. 무딘 끝 핀셋을 사용하여 건강한 유충을 필터 종이 층이 늘어선 페트리 접시에 조심스럽게 세고 사용전까지 어둠 속에서 실온에 보관하십시오.
94mm 직경의 원형 필터 용지를 평평한 올려진 표면에 테이핑하여 사출 플랫폼을 준비합니다. 멸균 PBS-T의 세 부피로 살균, 폐기 및 더 헹구기 위해 25 마이크로 리터 마이크로 리터 마이크로 시링에 70 % 에탄올의 세 볼륨을 흡인. 그런 다음, 준비된 BCG 럭스 접종을 중단하고 10 마이크로리터를 살균 된 마이크로시링으로 재보종으로 재차 리위퍼드합니다.
별도의 주사기를 사용하여 PBS-T를 흡인하여 음수 제어를 합니다. 다음 10 주사, 균일 한 세포 현탁액을 보장하기 위해 BCG 럭스 접종을 중단. 핀셋을 사용하여 애벌레 한 마리를 집어 주입 플랫폼에 배치하십시오.
플랫폼에서, 그 뒷면에 애벌레를 뒤집어 핀셋으로 머리와 꼬리를 고정하여 고정. 마지막 왼쪽 프래그릿을 찾아 애벌레의 머리에서 카운트다운하고 조심스럽게 10~ 20도 각도에서 바늘의 끝을 5~6밀리미터 깊이로 수평 평면에 삽입한다. 주사기에서 접종을 주입합니다.
각 감염 후 감염된 애벌레를 필터 용지 층이 늘어선 페트리 접시에 옮기습니다. 94mm 페트리 요리 한 개를 사용하면 최대 30개의 애벌레를 수용할 수 있습니다. 페트리 접시를 37°C의 인큐베이터 안에 5%의 이산화탄소를 넣은 통풍이 진 한 어두운 상자에 보관하십시오.
24시간마다 애벌레의 생존을 모니터링합니다. 애벌레는 터치에 대한 응답으로 움직이지 않을 때 죽은 것으로 간주됩니다. 생존을 기록하고 Mantel-Cox 시험으로 통계적 유의성을 평가합니다.
매 24시간마다 감염된 유충 5마리를 무작위로 선택하고 70%에탄올에 담근 면봉을 사용하여 애벌레 표면을 부드럽게 살균합니다. 애벌레를 멸균 PBS 800 마이크로리터를 함유한 2밀리리터 용액 매트릭스 튜브에 개별적으로 넣습니다. 그런 다음 균질화제를 사용하여 초당 6미터에서 60초 동안 유충을 균질화합니다.
3, 500회 g의 리싱 튜브를 원심분리하여 뚜껑에서 균모를 제거하고 5개의 멸균 광막계 튜브로 개별적으로 균일하게 제거합니다. 멸균 1.5 밀리리터 반응 튜브에 100 마이크로리터의 균질리터를 예약하십시오. PBS-T의 1밀리리터와 파이펫을 해당 광미계 튜브에 세척하여 남은 동종유를 회수합니다.
광피계 관을 소용돌이치며 발광계에서 균질화의 생물 발광을 측정합니다. 그런 다음 PBS-T를 사용하여 24웰 배양 판에서 예약된 100 마이크로리터의 10배 연속 희석을 준비합니다. 각 미들브룩 7H11 마고 플레이트에 희석제 의 파이펫 10 마이크로리터를 사용하고 멸균 플레이트 스프레더를 사용하여 확산시다.
2 주 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그 후, 식민지 형성 단위를 계산합니다. 생체 내 감염에 따라 BCG 럭스의 RLU 대 CFU 비율을 결정한다.
이 실험에서, BCG 럭스 용량 의존 독성은 96 시간 잠복기 동안 G.mellonella 애벌레에서 관찰되었다. 50%의 애벌레 사망률에 필요한 치명적인 투여량은 7개의 CFU의 힘에 1회 10회로 결정되었다. PBS-T의 10 마이크로 리터 용량으로 주입 된 대조군 또는 단순히 바늘 부상을 모방 하는 그 애벌레 건강에 영향을 미치지 않았다 또는 사망률의 증가 이어질.
BCG 럭스의 7개의 CFU 용량의 힘으로 2회 10에 감염된 애벌레의 경우, 유충 등선의 멜라늄화는 감염 후 48시간 후 감염 및 전신 멜라늄화로부터 관찰되었다 96시간 후 감염 후 감염에서 관찰되었다. BCG 럭스의 7개의 CFU 복용량의 힘에 10번 10의 감염을 가진 감염은 감염 후 첫번째 72 시간 안에 생물 발광의 초기 쇠퇴 귀착되었습니다. 그러나, 감염 후 72 시간 후, BCG 럭스의 생물 발광은 고원하기 시작, 지속적인 감염의 설립을 나타내는.
이 특정 감염 시스템에서 RLU 및 CFU의 생체 내 비율은 2:1에서 5:1까지 168시간 동안 평균 4:1로 다양했습니다. 주입 하는 동안, 과잉 침투의 위험을 최소화 되도록 애벌레를 확보 하는 것을 기억. 창자의 우발적인 펑크는 증가한 사망으로 이끌어 낼 수 있었습니다.
조직 병리학 적 분석을 수행함으로써 숙주 세포와 함께 균균의 도입을 시각화 할 수 있습니다. 추가 전사 분석은 게놈 수준에서 상호 작용을 밝힐 수 있었습니다. 이 감염 모형의 사용은 발달에 있는 초기 단계에서 새로운 약 후보의 급속한 시험을 허용할 수 있습니다, 크게 약 검열에 사용된 동물의 수를 감소시킵니다.
이 감염 모형은 바늘 막대기 상해와 연관될 수 있는 주사기의 사용을 요구합니다. 이러한 위험을 최소화하기 위해 사출 기술을 사용하는 것이 좋습니다.
