Ce protocole décrit l’utilisation de Galleria mellonella comme modèle alternatif d’infection pour étudier la tuberculose, réduisant ainsi le nombre de modèles mammifères utilisés dans la recherche. Par rapport aux modèles mammifères conventionnels tels que les souris, Galleria mellonella est un modèle moins cher, éthiquement acceptable et plus accessible pour étudier la tuberculose. Une optimisation plus continue de ce modèle permettra de dépistage de l’efficacité et de la toxicité des médicaments antimycobactériens candidats et contribuera au développement de nouvelles thérapeutiques pour la tuberculose dont on a un besoin urgent.
Galleria mellonella possède un système immunitaire inné complexe comparable à celui des mammifères. L’étude de l’interaction hôte-pathogène peut révéler davantage le rôle de l’immunité innée dans la tuberculose. L’utilisation de Galleria mellonella comme modèle d’infection ne se limite pas à la tuberculose et a été largement utilisée pour d’autres pathogènes bactériens et fongiques au cours de la dernière décennie.
Pour commencer, décongeler un stock congelé de glycérol de 1,2 millilitre de Mycobacterium bovis BCG lux, la souche vaccinale montréalaise transformée avec le plasmide navette pSMT1 transportant les gènes luxAB. Dans un flacon Erlenmeyer de 250 millilitres étiqueté, inoculer 15 millilitres de bouillon Middlebrook 7H9 avec un aliquot décongelé de 1,2 millilitre de BCG lux. Placez le flacon dans un contenant de biosécurité scellé et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur de shaker orbital à 220 rpm pendant 72 heures.
Après l’incubation, préparer 1:10 dilutions de la culture dans la solution saline tamponnée de phosphate dans les tubes de luminomètre, vortex, et charger les tubes de luminomètre dans le luminomètre. Chargez le substrat 1%n-decyl aldéhyde dans l’éthanol absolu dans la plate-forme injecteur et mesurer la bioluminescence. Convertir la bioluminescence en unités formant des colonies pour vérifier la croissance de la culture bcg lux.
Transférer la culture dans un tube de centrifugeuse et une centrifugeuse à 2 175 fois g pendant 10 minutes à température ambiante pour pelleter les cellules. Jetez le supernatant dans un désinfectant approprié avec l’activité mycobactérienne connue. Lavez la pastille de cellules deux fois dans 50 millilitres de PBS-T en centrifugant à 2, 175 fois g pendant 10 minutes pour empêcher l’agglutination bactérienne.
Après le lavage final, décanter le supernatant de déchets et résuspendre la pastille de cellules mycobactériennes dans le volume requis de PBS-T pour diluer la suspension mycobactérienne à la densité cellulaire désirée. Ensuite, préparez 10 dilutions périodiques de l’inoculum dans des plaques de 24 puits à l’aide de PBS-T. Plaquez 10 microlitres de chaque dilution sur les plaques d’agar Middlebrook 7H11 en double pour énumérer les comptes d’inoculum CFU.
Maintenir les larves de instar achetées dans l’obscurité à 18 degrés Celsius à l’arrivée et utiliser dans la semaine qui a après l’achat. Identifier et sélectionner des larves saines pour l’expérimentation en fonction de la couleur uniforme de la crème, de la taille et du poids appropriés, de la grande motilité et de la capacité de se remettre. À l’aide d’une pince à épiler à extrémité émoussée, comptez soigneusement les larves en bonne santé dans une boîte de Pétri tapissée d’une couche de papier filtre et conservez-les à température ambiante dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
Préparez la plate-forme d’injection en enlevant un papier filtre circulaire de 94 millimètres de diamètre sur une surface plane et surélevée. Aspirez trois volumes d’éthanol à 70 % dans une microsyringe de 25 microlitres pour stériliser, jeter et rincer davantage avec trois volumes de PBS-T stérile. Ensuite, resuspendez l’inoculum préparé de lux de BCG et aspirez 10 microlitres dans la microsyringe stérilisée.
Utilisez une seringue séparée pour aspirer PBS-T pour un contrôle négatif. Après 10 injections, resuspendez l’inoculum de lux de BCG pour assurer la suspension cellulaire uniforme. Utilisez une pince à épiler pour ramasser une larve et la placer sur la plate-forme d’injection.
Sur la plate-forme, retourner la larve sur le dos et immobiliser en sécurisant la tête et la queue avec les pinces. Localisez le dernier proleg gauche, en comptant vers le bas de la tête de la larve et insérez soigneusement la pointe de l’aiguille de cinq à six millimètres de profondeur à un angle de 10 à 20 degrés au plan horizontal. Injecter l’inoculum de la seringue.
Après chaque infection, transférer la larve infectée dans une boîte de Pétri tapissée d’une couche de papier filtre. Une seule boîte de Pétri de 94 millimètres peut accueillir jusqu’à 30 larves. Conservez la boîte de Pétri dans une boîte noire ventilée à l’intérieur d’un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.
Surveillez la survie des larves toutes les 24 heures. Les larves sont considérées comme mortes lorsqu’elles ne se déplacent pas en réponse au toucher. Enregistrez la survie et évaluez la signification statistique avec le test de Mantel-Cox.
Toutes les 24 heures, sélectionnez au hasard cinq larves infectées et utilisez un coton-tige trempé dans 70 % d’éthanol pour stériliser doucement les surfaces larvaire. Placez les larves individuellement dans des tubes matriciels de lysage de deux millilitres contenant 800 microlitres de PBS stérile. Ensuite, utilisez un homogénéisateur pour homogénéiser les larves pendant 60 secondes à six mètres par seconde.
Centrifuger les tubes de lysing à 3500 fois g pendant cinq secondes pour enlever l’homogénéité des couvercles et décanter soigneusement l’homogénéité en cinq tubes de luminomètre stériles individuellement. Réservez 100 microlitres d’homogénéité dans un tube de réaction stérile de 1,5 millilitre. Récupérez tout homogénéité restant en lavant les tubes matriciels de lysage avec un millilitre de PBS-T et pipette dans les tubes de luminomètre correspondants.
Vortex les tubes de luminomètre et de mesurer la bioluminescence des homogénées sur un luminomètre. Ensuite, préparez 10 dilutions périodiques des 100 microlitres réservés d’homogénéité dans des plaques de culture de 24 puits à l’aide de PBS-T. Pipette 10 microlitres de la dilution sur chaque plaque d’agar Middlebrook 7H11 et utiliser un épandeur stérile de plaques pour se propager.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux semaines. Après cela, comptez les unités formant des colonies. Déterminer le rapport RLU/CFU de BCG lux suite à une infection in vivo.
Dans cette expérience, la virulence dépendante de la dose de BCG lux a été observée chez les larves de G.mellonella sur une période d’incubation de 96 heures. La dose létale requise pour la mortalité larvaire de 50% a été déterminée pour être une fois 10 à la puissance de sept CFU. Les groupes de contrôle injectés avec une dose de 10 microlitres de PBS-T ou ceux simplement piqués simulant des dommages d’aiguille n’ont pas affecté la santé larvaire ou mènent à une augmentation de la mortalité.
Pour les larves infectées par les deux fois 10 à la puissance de sept dose de CFU de BCG lux, la mélanisation de la lignée dorsale larvaire a été observée à partir de 48 heures après l’infection et la mélanisation systémique a été observée à partir de 96 heures après l’infection. L’infection avec une fois 10 à la puissance de sept dose de CFU de BCG lux a eu comme conséquence un déclin initial de bioluminescence dans les 72 premières heures après infection. Cependant, après 72 heures après infection, la bioluminescence de BCG lux a commencé à plafonner, indiquant l’établissement de l’infection persistante.
Dans ce système d’infection particulier, le rapport in vivo de RLU et de CFU fonçait de 2:1 à 5:1 avec une moyenne de 4:1 au cours du cours de 168 heures. Pendant l’injection, n’oubliez pas de fixer les larves afin que le risque de surpénétration soit réduit au minimum. La perforation accidentelle de l’intestin pourrait entraîner une augmentation de la mortalité.
En effectuant l’analyse histopathologique, l’introduction des mycobactéries avec les cellules hôtes peut être visualisée. Une analyse transcriptomique plus poussée pourrait révéler l’interaction au niveau génomique. L’utilisation de ce modèle d’infection peut permettre de tester rapidement de nouveaux candidats médicaments à un stade précoce du développement, réduisant considérablement le nombre d’animaux utilisés dans le dépistage des médicaments.
Ce modèle d’infection nécessite l’utilisation d’une seringue, qui peut être associée à des blessures par piqûre d’aiguille. Nous recommandons l’utilisation de notre technique d’injection pour minimiser ce risque.
