Bu protokol, galleria mellonella'nın tüberküloz üzerinde çalışmak için alternatif bir enfeksiyon modeli olarak kullanımını açıklamaktadır ve araştırmada kullanılan memeli modellerinin sayısını azaltır. Fareler gibi geleneksel memeli modelleri ile karşılaştırıldığında, Galleria mellonella tüberküloz çalışmak için daha ucuz, etik olarak kabul edilebilir ve daha erişilebilir bir modeldir. Bu modelin daha fazla optimizasyon aday antimikobakteriyel ilaç etkinliği ve toksisitesi tarama için izin verecek ve tüberküloz için acil ihtiyaç duyulan yeni terapötik gelişimine katkıda bulunacaktır.
Galleria mellonella memelilerinkiyle karşılaştırılabilir karmaşık bir doğuştan gelen bağışıklık sistemine sahip. Konak-patojen etkileşimi çalışması tüberkülozda doğuştan gelen bağışıklığın rolünü daha da ortaya çıkarabilir. Bir enfeksiyon modeli olarak Galleria mellonella kullanımı tüberküloz ile sınırlı değildir ve yaygın olarak son on yıl içinde diğer bakteriyel ve mantar patojenler için kullanılmıştır.
Başlamak için, Mycobacterium bovis BCG lux bir dondurulmuş 1.2 mililitrelik gliserol stok defrost, Montreal aşı suşu luxAB genleri taşıyan mekik plazmid pSMT1 ile dönüştürülmüştür. Etiketli 250 mililitrelik Erlenmeyer şişesinde, 15 mililitre Middlebrook 7H9 suyu ile 1.2 mililitrelik BCG lux'un buzunu çözün. Şişeyi kapalı bir biyogüvenlik kabına yerleştirin ve 37 santigrat derecede 72 saat boyunca 220 rpm'de orbital shaker inkübatörde kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, luminometre tüpleri, girdap larda fosfat tamponlu tuzlu 1:10 kültür seyreltme hazırlamak ve luminometre tüpleri luminometre içine yükleyin. Substrat 1%n-decyl aldehitmutlak etanol enjektör platformu içine yük ve biyolüminesans ölçmek. BCG lux kültürünün büyümesini kontrol etmek için biyolüminesansı koloni oluşturan birimlere dönüştürün.
Kültürü 2, 175 kez g'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın. Bilinen mikobactericidal aktivite ile uygun bir dezenfektan içine supernatant atın. Hücre peletini 50 mililitre PBS-T'de 2, 175 kez g santrifüj ederek iki kez yıkayın ve bakteri kümelenmesini önleyin.
Son yıkamadan sonra, mikobakteriyel süspansiyonu istenilen hücre yoğunluğuna seyreltmek için atık süpernatantını decant ve gerekli miktarda ki mikobakteriyel hücre peletini pbs-T'nin gerekli hacminde yeniden askıya alın. Daha sonra, PBS-T kullanarak 24 kuyulu plakalarda inokül 10 kat seri seyreltme hazırlayın. Inoculum CFU sayımlarını saymak için yinelenen Middlebrook 7H11 agar plakaları üzerine her seyreltme 10 mikrolitre dışarı plaka.
Satın alınan yıldız larvalarını varışta 18 santigrat derecede karanlıkta koruyun ve satın alma işleminden sonraki bir hafta içinde kullanın. Tek tip krem rengi, uygun boyut ve ağırlık, yüksek hareketlilik ve teslim edildiğinde kendilerini düzeltme yeteneğine sahip dayalı deneme için sağlıklı larvaları belirleyin ve seçin. Künt uçlu cımbız kullanarak, sağlıklı larvaları filtre kağıdı tabakası ile kaplı bir Petri kabına dikkatlice sayın ve kullanıma kadar karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.
94 milimetre çapında dairesel filtre kağıdını düz, yükseltilmiş bir yüzeye bantlayarak enjeksiyon platformuna hazırlayın. Sterilize etmek, atmak ve steril PBS-T üç cilt ile daha fazla durulamak için 25 mikrolitrelik bir mikroşinil içine% 70 etanol üç cilt aspire. Daha sonra, sterilize mikroşiniş içine hazırlanan BCG lux inoculum ve aspire 10 mikrolitre resuspend.
Negatif kontrol için PBS-T aspirate için ayrı bir şırınga kullanın. 10 enjeksiyondan sonra, tek tip hücre süspansiyonu sağlamak için BCG lux inoculum'u yeniden askıya alın. Bir larva almak ve enjeksiyon platformu üzerine yer için cımbız kullanın.
Platformda larvayı sırtına çevirin ve cımbızla baş ve kuyruğu nu emniyete alarak hareketsiz kalın. Larvanın başından geriye doğru sayarak son sol deleg'i bulun ve iğnenin ucunu yatay düzleme 10 ila 20 derecelik bir açıyla 5 ila 6 milimetre derine dikkatlice yerleştirin. Şırıngadan inoculumu enjekte edin.
Her enfeksiyondan sonra, enfekte larvayı filtre kağıdı tabakası ile kaplı bir Petri kabına aktarın. Tek bir 94 milimetrelik Petri çanak kadar 30 larva barındırabilir. Petri kabını %5 karbondioksitle 37 derecede bir kuvözde havalanmış, karanlık bir kutuda saklayın.
Her 24 saatte bir larvaların hayatta kalmasını izleyin. Larvalar dokunmaya tepki olarak hareket edemediklerinde ölü olarak kabul edilirler. Mantel-Cox testi ile sağkalımı kaydedin ve istatistiksel anlamlılığı değerlendirin.
Her 24 saatte bir, rastgele beş enfekte larva seçin ve hafifçe larva yüzeyleri sterilize etmek için% 70 etanol batırılmış bir pamuk tomurcuk bezi kullanın. Larvaları tek tek 800 mikrolitre steril PBS içeren iki mililitrelik matris tüplere yerleştirin. Daha sonra, larvaları saniyede 6 metre de 60 saniye homojenize etmek için bir homogenizer kullanın.
Homojeni kapaklardan çıkarmak için 3, 500 kez g'de 5 saniyede sandrifut yapın ve homojeni tek tek beş steril luminometre tüpüne ayırın. Steril 1,5 mililitrelik reaksiyon tüpünde 100 mikrolitre homojenlik ayırın. Kalan homojenleri, bir mililitre PBS-T ve pipetle ilgili luminometre tüplerine yıkayarak kurtarın.
Vortex luminometer tüpleri ve bir luminometre üzerinde homojenatların biyolüminesans ölçmek. Daha sonra, PBS-T kullanarak 24 kuyulu kültür plakalarında ayrılmış 100 mikrolitre homojenin 10 kat seri seyreltmelerini hazırlayın. Pipet her Middlebrook 7H11 agar plaka üzerine seyreltme 10 mikrolitre ve yaymak için steril bir plaka dağıtıcı kullanın.
İki hafta boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Ondan sonra koloni oluşturan birimleri say. In vivo enfeksiyon sonrası BCG lux RLU-CFU oranını belirleyin.
Bu deneyde G.mellonella larvalarında 96 saatlik kuluçka döneminde BCG lux doza bağımlı virülans gözlendi. %50 larva mortalitesi için gerekli olan öldürücü doz, yedi CFU gücünde 10 kat daha fazla olarak belirlendi. PBS-T 10 mikrolitre doz ile enjekte kontrol grupları veya bu sadece iğne yaralanmaları simüle iğne lerva sağlığını etkilemez veya mortalite artışına yol açmadı.
BcG lux yedi CFU dozu gücüne iki kez 10 ile enfekte larvalar için, larva dorsal line melanizasyon gözlendi 48 saat sonrası enfeksiyon ve sistemik melanizasyon gözlendi 96 saat sonrası enfeksiyon. BCG lux yedi CFU dozu gücüne bir kez 10 ile enfeksiyon ilk 72 saat sonrası enfeksiyon içinde biyolüminesans ilk düşüş ile sonuçlandı. Ancak, enfeksiyon sonrası 72 saat sonra, BCG lux biyolüminesans yayla başladı, kalıcı enfeksiyon kurulması gösteren.
Bu özel enfeksiyon sisteminde, RLU ve CFU in vivo oranı 168 saatlik zaman dilimi boyunca ortalama 4:1 ile 2:1 ile 5:1 arasında değişmektedir. Enjeksiyon sırasında, aşırı penetrasyon riskinien aza indirmek böylece larvaları güvenli unutmayın. Kazara bağırsak delinmesi mortalitenin artmasına neden olabilir.
Histopatolojik analizler ile mikobakterilerin konak hücrelerle tanıştırılması görselleştirilebilir. Daha fazla transkripsiyonel analiz genomik düzeyde etkileşimortaya çıkarabilir. Bu enfeksiyon modelinin kullanımı, yeni ilaç adaylarının gelişimin erken bir aşamasında hızlı bir şekilde test edilmesine olanak sağlayarak, uyuşturucu taramasında kullanılan hayvan sayısını önemli ölçüde azaltabilir.
Bu enfeksiyon modeli iğne-sopa yaralanması ile ilişkili olabilir bir şırınga, kullanımını gerektirir. Bu riski en aza indirmek için enjeksiyon tekniğimizi kullanmanızı öneririz.
