このプロトコルは、ガレリアメロネラを結核を研究するための代替感染モデルとして使用し、研究に使用される哺乳類モデルの数を減らすことを説明する。マウスなどの従来の哺乳類モデルと比較すると、ガレリアメロネラは結核を研究するための安価で倫理的に受け入れられ、よりアクセスしやすいモデルです。このモデルのさらなる最適化は、候補の抗菌薬の有効性と毒性のスクリーニングを可能にし、結核に対する緊急に必要な新しい治療薬の開発に貢献するであろう。
ガレリアメロネラは、哺乳類に匹敵する複雑な自然免疫系を有する。宿主と病原体の相互作用の研究は、結核における自然免疫の役割をさらに明らかにすることができる。感染モデルとしてのガレリアメロネラの使用は結核に限定されず、過去10年間に他の細菌および真菌病原体に広く使用されてきた。
まず、マイコバクテリウムボビスBCGルクスの凍結1.2ミリリットルグリセロールストックを解凍し、モントリオールワクチン株はluxAB遺伝子を運ぶシャトルプラスミドpSMT1で形質転換した。標識された250ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコでは、BCGルクスの解凍された1.2ミリリットルのアリコートを含むミドルブルック7H9ブロスの15ミリリットルを接種する。密閉されたバイオセーフティ容器にフラスコを入れ、220rpmの軌道シェーカーインキュベーターで摂氏37度で72時間インキュベートします。
インキュベーション後、リン酸緩衝生理食塩基の1:10希釈液を、光度計管、渦、照明計管に集め、ルミノメーターにロードします。絶対エタノール中の1%nデシルアルデヒドを注入プラットフォームに積み込み、生物発光を測定します。生物発光をコロニー形成ユニットに変換し、BCGルクス培養の成長を確認します。
培養液を遠心管及び遠心分離機に2、175回gを室温で10分間移し、細胞をペレット化する。上清を、既知のマイコバクテリダル活性を有する適切な消毒剤に廃棄する。細胞ペレットをPBS-Tの50ミリリットルで2回、2で遠心分離して10分間175回洗浄し、細菌の凝集を防ぎます。
最終洗浄後、無駄な上清をデカントし、必要な量のPBS-Tでマイコバクテリア細胞ペレットを再懸濁し、マイコバクテリア懸濁液を所望の細胞密度に希釈します。次に、PBS-Tを用いて24ウェルプレートに接種物の10倍の連続希釈液を調製する。各希釈液の10マイクロリットルをミドルブルック7H11寒天プレートに重し、接種CFUカウントを列挙します。
到着時に摂氏18度で暗闇の中で購入したインスター幼虫を維持し、購入後1週間以内に使用してください。均一なクリーム色、適切なサイズと体重、高い運動性、そしてひっくり返ったときに自分自身を右にする能力を持って、実験のための健康な幼虫を識別し、選択します。鈍端のピンセットを使用して、慎重に濾紙の層が並ぶペトリ皿に健康な幼虫を数え、使用するまで暗闇の中で室温で保存します。
直径94ミリの円形フィルターペーパーを平らな隆起面にテーピングして、射出プラットフォームを準備します。70%エタノールの3つのボリュームを25マイクロシリンジに吸い込み、滅菌、廃棄、さらに3巻の滅菌PBS-Tでリンスします。次いで、調製したBCG lux inoculumを再懸濁し、滅菌したマイクロシリンジに10マイクロリットルを吸引する。
別のシリンジを使用して、陰性対照のためにPBS-Tを吸引する。10回の注射に続いて、均一な細胞懸濁液を確保するためにBCG lux接種を再中断する。ピンセットを使用して1つの幼虫を拾い、注射プラットフォームに配置します。
プラットフォーム上で、幼虫を背中にひっくり返し、ピンセットで頭と尾を固定して固定します。幼虫の頭からカウントダウンし、慎重に水平面に10〜20度の角度で深さ5〜6ミリメートルの針の先端を挿入し、最後の左のプロレッグを見つけます。注射器から接種物を注入する。
各感染後、感染した幼虫を濾紙の層が並ぶペトリ皿に移す。1つの94ミリメートルのペトリ皿は30までの幼虫を収容できる。ペトリ皿を5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーター内の通気入りの暗い箱に保管します。
24時間ごとに幼虫の生存を監視します。幼虫は、彼らがタッチに応答して移動するために失敗したときに死んだと見なされます。生存を記録し、マンテル-コックス検定で統計的有意性を評価する。
24時間ごとに、感染した5匹の幼虫を無作為に選択し、70%エタノールに浸した綿棒綿棒を使用して幼虫表面を穏やかに殺菌する。幼虫を800マイクロリットルの無菌PBSを含む2ミリリットルの溶菌マトリックスチューブに個別に入れる。次に、ホモジナイザーを使用して、幼虫を毎秒6メートルで60秒間ホモジナイズします。
3、500回gで500回の間に500回の遠心分離チューブは、蓋からホモゲネートを除去し、慎重に5つの無菌ルルミノメーターチューブにホモゲネートを個別にデカントする。滅菌1.5ミリリットル反応管にホモゲネートの100マイクロリットルを予約します。PBS-Tとピペットを1ミリリットルで溶精マトリックスチューブを対応するルミノメーターチューブに洗浄して、残りのホモゲネートを回収します。
照明計管を渦、そして、照明計のホモジネートの生物発光を測定する。次いで、PBS-Tを用いて24ウェル培養プレートに100マイクロリットルのホモジネートを予約した10倍の連続希釈液を調製する。各ミドルブルック7H11寒天板に希釈のピペット10マイクロリットル及び広がりに滅菌プレートスプレッダーを使用する。
摂氏37度で2週間インキュベートします。その後、コロニー形成ユニットを数えます。インビボ感染後のBCGルクスのRLU対CFU比を決定する。
この実験では、96時間のインキュベーション期間にわたってG.メロネラ幼虫でBCG lux用量依存性の毒性が観察された。50%幼虫死亡率に必要な致死量は、7つのCFUの力に対して10倍であると判断した。PBS-Tの10マイクロリットル用量を注射した対照群または単に針の傷害をシミュレートしたものは、幼虫の健康に影響を与えなかったか、死亡率の増加につながった。
BCGルクスの7回CFU線量の2回10に感染した幼虫について、感染後48時間から幼虫背部線のメラニンが観察され、感染後96時間から全身メラニンが観察された。BCGルクスの7つのCFU用量の1倍の10の感染は、感染後の最初の72時間以内に生物発光の最初の減少をもたらした。しかし、感染後72時間後、BCGルクスの生物発光が高原に始まり、持続性感染の確立を示す。
この特定の感染系では、RLUとCFUのインビボ比は2:1から5:1の範囲で、168時間のタイムコースで平均4:1でした。注射中は、侵入のリスクが最小限になるように幼虫を確保することを忘れないでください。腸の偶発的な穿刺は、死亡率の増加につながる可能性があります。
組織病理学的解析を行うことにより、宿主細胞を用いたマイコバクテリアの導入を可視化できる。さらなる転写分析は、ゲノムレベルでの相互作用を明らかにすることができる。この感染モデルの使用は、開発の初期段階で新しい薬物候補の迅速な検査を可能にし、薬物スクリーニングに使用される動物の数を大幅に減らすことができる。
この感染モデルは、針刺しの傷害に関連付けることができる注射器の使用を必要とする。このようなリスクを最小限に抑えるために、注射技術の使用をお勧めします。
