Este protocolo descreve o uso da Galleria mellonella como um modelo alternativo de infecção para estudar a tuberculose, reduzindo o número de modelos mamíferos utilizados na pesquisa. Quando comparada com modelos convencionais de mamíferos, como camundongos, a Galleria mellonella é um modelo mais barato, eticamente aceitável e mais acessível para estudar a tuberculose. Uma maior otimização desse modelo permitirá a triagem da eficácia e toxicidade de medicamentos antimicobacterianos candidatos e contribuirá para o desenvolvimento de novas terapêuticas urgentemente necessárias para a tuberculose.
Galleria mellonella possui um complexo sistema imunológico inato comparável ao dos mamíferos. O estudo da interação hospedeiro-patógeno pode revelar ainda mais o papel da imunidade inata na tuberculose. O uso da Galleria mellonella como modelo de infecção não se limita à tuberculose e tem sido amplamente utilizado para outros patógenos bacterianos e fúngicos na última década.
Para começar, descongele um estoque de glicerol congelado de 1,2 mililitro de Mycobacterium bovis BCG lux, a cepa de vacina de Montreal transformada com o pSMT1 de transporte plasmídeo carregando os genes luxAB. Em um frasco de 250 mililitros erlenmeyer, inoculado 15 mililitros de caldo Middlebrook 7H9 com uma alíquota de 1,2 mililitro de BCG lux. Coloque o frasco em um recipiente de biossegurança selado e incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora de shaker orbital a 220 rpm por 72 horas.
Após a incubação, prepare 1:10 diluições da cultura em soro fisiológico tamponado por fosfato em tubos luminômetros, vórtice e carregue os tubos de luminômetro no luminômetro. Carregue o substrato 1%n-decidido em etanol absoluto na plataforma injetor e meça a bioluminescência. Converta a bioluminescência em unidades formadoras de colônias para verificar o crescimento da cultura BCG lux.
Transfira a cultura para um tubo de centrífuga e centrífuga a 2.175 vezes g por 10 minutos à temperatura ambiente para pelotar as células. Descarte o supernasal em um desinfetante apropriado com atividade micobactericida conhecida. Lave a pelota celular duas vezes em 50 mililitros de PBS-T por centrifugação a 2.175 vezes g por 10 minutos para evitar a aglomeração bacteriana.
Após a lavagem final, decante o supernanato de resíduos e resuspendice a pelota de célula micobacteriana no volume necessário de PBS-T para diluir a suspensão micobacteriana à densidade celular desejada. Em seguida, prepare diluições seriais de 10 vezes do inóculo em placas de 24 poços usando PBS-T. Emplaque 10 microliters de cada diluição em placas de ágar Middlebrook 7H11 em duplicata para enumerar contagens de CFU inóculo.
Mantenha as larvas instar compradas no escuro a 18 graus Celsius na chegada e use dentro de uma semana após a compra. Identifique e selecione larvas saudáveis para experimentação com base na cor do creme uniforme, tamanho e peso adequados, alta motilidade e possuindo a capacidade de se corrigir quando virado. Usando pinças de ponta sem corte, conte cuidadosamente as larvas saudáveis em uma placa de Petri forrada com uma camada de papel filtro e armazene à temperatura ambiente no escuro até o uso.
Prepare a plataforma de injeção gravando um papel filtro circular de 94 milímetros de diâmetro em uma superfície plana e elevada. Aspire três volumes de 70% de etanol em uma microsiringe de 25 microliter para esterilizar, descartar e enxaguar ainda mais com três volumes de PBS-T estéreis. Em seguida, resuspenque o inóculo BCG lux preparado e aspire 10 microliters na microsiringe esterilizada.
Use uma seringa separada para aspirar PBS-T para um controle negativo. Após 10 injeções, resuspenja o bcg lux inóculo para garantir a suspensão uniforme da célula. Use pinças para pegar uma larva e colocar na plataforma de injeção.
Na plataforma, vire a larva para as costas e imobilize,prendendo a cabeça e a cauda com a pinça. Localize o último proleg esquerdo, em contagem regressiva da cabeça da larva e insira cuidadosamente a ponta da agulha de cinco a seis milímetros de profundidade em um ângulo de 10 a 20 graus para o plano horizontal. Injete o inóculo da seringa.
Após cada infecção, transfira a larva infectada para uma placa de Petri forrada com uma camada de papel filtro. Uma única placa de Petri de 94 milímetros pode acomodar até 30 larvas. Armazene a placa de Petri em uma caixa escura e ventilada dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Monitore a sobrevivência das larvas a cada 24 horas. Larvas são consideradas mortas quando não se movem em resposta ao toque. Regissão a sobrevida e avalie a significância estatística com o teste de Mantel-Cox.
A cada 24 horas, selecione aleatoriamente cinco larvas infectadas e use um cotonete de algodão embebido em 70% de etanol para esterilizar suavemente as superfícies larval. Coloque as larvas individualmente em tubos de matriz de dois mililitros contendo 800 microliters de PBS estéreis. Em seguida, use um homogeneizador para homogeneizar as larvas por 60 segundos a seis metros por segundo.
Centrifugar os tubos de lise a 3.500 vezes g durante cinco segundos para remover o homogeneato das tampas e decantar cuidadosamente o homogeneizar em cinco tubos luminômetros estéreis individualmente. Reserve 100 microlitadores de homogeneizar em um tubo de reação estéril de 1,5 mililitro. Recupere qualquer homogeneizar restante lavando os tubos de matriz de lise com um mililitro de PBS-T e pipeta nos tubos de luminômetro correspondentes.
Vórtice dos tubos luminómetros e medir a bioluminescência dos homogeneiza em um luminômetro. Em seguida, prepare diluições seriais 10 vezes dos 100 microlitadores reservados de homogeneizar em placas de cultura de 24 poços usando PBS-T. Pipeta 10 microliters da diluição em cada placa de ágar Middlebrook 7H11 e use um espalhador de placa estéril para espalhar.
Incubar a 37 graus Celsius por duas semanas. Depois disso, conte unidades formadoras de colônias. Determine a razão RLU para CFU de BCG lux após infecção in vivo.
Neste experimento, a virulência dependente de dose BCG lux foi observada em larvas G.mellonella durante um período de incubação de 96 horas. A dose letal necessária para mortalidade larval de 50% foi determinada em uma vezes 10 ao poder de sete UFC. Grupos de controle injetados com uma dose de 10 microliter de PBS-T ou aqueles simplesmente picados simulando lesões de agulha não afetaram a saúde larval ou levaram a um aumento da mortalidade.
Para larvas infectadas com as duas vezes 10 à potência de sete doses de UFC lux, observou-se melanização da linha dorsal larval a partir de 48 horas após a infecção e observou-se melanização sistêmica a partir de 96 horas após a infecção. A infecção com uma dose de uma vezes 10 ao poder de sete doses de CFU de BCG lux resultou em um declínio inicial da bioluminescência nas primeiras 72 horas após a infecção. No entanto, após 72 horas após a infecção, a bioluminescência da BCG lux começou a planar, indicando o estabelecimento de infecção persistente.
Neste sistema de infecção em particular, a razão in vivo de RLU e CFU variou de 2:1 a 5:1 com uma média de 4:1 ao longo do curso de 168 horas. Durante a injeção, lembre-se de fixar as larvas para que o risco de sobrepenetração seja minimizado. Punção acidental do intestino pode levar ao aumento da mortalidade.
Ao realizar análise histopatológica, a introdução de micobactérias com as células hospedeiras pode ser visualizada. Uma análise transcriômica adicional pode revelar a interação no nível genômico. O uso deste modelo de infecção pode permitir o teste rápido de novos candidatos a medicamentos em um estágio inicial de desenvolvimento, reduzindo significativamente o número de animais usados na triagem de medicamentos.
Este modelo de infecção requer o uso de uma seringa, que pode estar associada a lesões de agulha.. Recomendamos o uso de nossa técnica de injeção para minimizar esse risco.
