Questo protocollo descrive l'uso della Galleria mellonella come modello di infezione alternativo per studiare la tubercolosi, riducendo il numero di modelli di mammiferi utilizzati nella ricerca. Rispetto ai modelli tradizionali di mammiferi come i topi, Galleria mellonella è un modello più economico, eticamente accettabile e più accessibile per studiare la tubercolosi. Un'ulteriore ottimizzazione di questo modello consentirà lo screening dell'efficacia e della tossicità dei farmaci antimicobatterici candidati e contribuirà allo sviluppo di nuove terapie urgenti per la tubercolosi.
Galleria mellonella possiede un complesso sistema immunitario innato paragonabile a quello dei mammiferi. Lo studio dell'interazione ospite-patogeno può rivelare ulteriormente il ruolo dell'immunità innata nella tubercolosi. L'uso della Galleria mellonella come modello di infezione non si limita alla tubercolosi ed è stato ampiamente utilizzato per altri agenti patogeni batterici e fungini nell'ultimo decennio.
Per iniziare, scongelare uno stock congelato di glicerolo da 1,2 millilitro di Mycobacterium bovis BCG lux, il ceppo vaccinale di Montreal trasformato con il pSMT1 plasmide shuttle che trasporta i geni luxAB. In un pallone Erlenmeyer da 250 millilitri etichettato, inoculare 15 millilitri di brodo Middlebrook 7H9 con un'aliquota scongelata da 1,2 millilitri di BCG lux. Posizionare il pallone in un contenitore di biosicurezza sigillato e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore di agitatori orbitali a 220 giri/min per 72 ore.
Dopo l'incubazione, preparare le diluizioni 1:10 della coltura in salina tamponata da fosfati in tubi luminometrici, vortice e caricare i tubi del luminometro nel luminometro. Caricare il substrato 1%n-aldeide in etanolo assoluto nella piattaforma dell'iniettore e misurare la bioluminescenza. Converti la bioluminescenza in unità che formano colonie per controllare la crescita della cultura lux BCG.
Trasferire la coltura in un tubo di centrifuga e centrifuga a 2, 175 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule. Scartare il supernatante in un disinfettante appropriato con attività micobattecida nota. Lavare il pellet cellulare due volte in 50 millilitri di PBS-T centrifugando a 2,175 volte g per 10 minuti per evitare l'accumulo batterico.
Dopo il lavaggio finale, decantare il supernatante di scarto e rimescolare il pellet di cellule micobatteriche nel volume richiesto di PBS-T per diluire la sospensione micobatterica alla densità cellulare desiderata. Quindi, preparare diluizioni seriali di 10 volte dell'inoculo in piastre a 24 pozzole utilizzando PBS-T. Placcare 10 microlitri di ogni diluizione su piastre di agar Middlebrook 7H11 in duplicato per enumerare i conteggi CFU dell'inoculo.
Mantieni le larve instar acquistate al buio a 18 gradi Celsius all'arrivo e usa entro una settimana dall'acquisto. Identifica e seleziona larve sane per la sperimentazione in base al colore uniforme della crema, alle dimensioni e al peso appropriati, all'elevata motilità e possedendo la capacità di destra se stessi quando vengono capovolti. Utilizzando una pinzetta con estremità smussata, contare attentamente le larve sane in una piastra di Petri foderata con uno strato di carta da filtro e conservare a temperatura ambiente al buio fino all'uso.
Preparare la piattaforma di iniezione toccando una carta filtrante circolare di 94 millimetri di diametro su una superficie piana e rialzata. Aspirare tre volumi di etanolo al 70% in un microsiringe da 25 microliter per sterilizzare, scartare e risciacquare ulteriormente con tre volumi di PBS-T sterile. Quindi, rimescolare l'inoculo bcg lux preparato e aspirare 10 microlitri nel microsiringe sterilizzato.
Utilizzare una siringa separata per aspirare pbs-t per un controllo negativo. Dopo 10 iniezioni, resuspend l'inoculo bcg lux per garantire una sospensione cellulare uniforme. Usa le pinzette per raccogliere una larva e posizionarlo sulla piattaforma di iniezione.
Sulla piattaforma, capovolgere la larva sulla schiena e immobilizzare fissando la testa e la coda con le pinzette. Individuare l'ultimo proleg sinistro, contando dalla testa della larva e inserire con cura la punta dell'ago da cinque a sei millimetri di profondità con un angolo da 10 a 20 gradi sul piano orizzontale. Iniettare l'inoculo dalla siringa.
Dopo ogni infezione, trasferire la larva infetta in una piastra di Petri rivestita con uno strato di carta da filtro. Una singola piastra di Petri da 94 millimetri può ospitare fino a 30 larve. Conservare la piastra di Petri in una scatola scura ventilata all'interno di un'incubatrice a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
Monitora la sopravvivenza delle larve ogni 24 ore. Le larve sono considerate morte quando non riescono a muoversi in risposta al tatto. Registrare la sopravvivenza e valutare la significatività statistica con il test di Mantel-Cox.
Ogni 24 ore, selezionare casualmente cinque larve infette e utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% per sterilizzare delicatamente le superfici larvali. Posizionare le larve singolarmente in tubi a matrice di lisciviatura a due millilitri contenenti 800 microlitri di PBS sterile. Quindi, utilizzare un omogeneizzatore per omogeneizzare le larve per 60 secondi a sei metri al secondo.
Centrifugare i tubi di liscipo a 3.500 volte g per cinque secondi per rimuovere l'omogeneato dai coperchi e decantare accuratamente l'omogeneato in cinque tubi luminometrici sterili singolarmente. Riservare 100 microlitri di omogeneato in un tubo di reazione sterile da 1,5 millilitri. Recuperare l'omogeneato rimanente lavando i tubi a matrice di llysing con un millilitro di PBS-T e pipetta nei corrispondenti tubi del luminometro.
Vortice i tubi del luminometro e misurare la bioluminescenza degli omogeneati su un luminometro. Quindi, preparare diluizioni seriali 10 volte dei 100 microlitri riservati di omogeneato in piastre di coltura a 24 pozzi utilizzando PBS-T. Pipettare 10 microlitri della diluizione su ogni piastra di agar Middlebrook 7H11 e utilizzare uno spargitore di piastre sterile per diffondersi.
Incubare a 37 gradi Celsius per due settimane. Dopo di ciò, conta le unità che formano colonie. Determinare il rapporto RLU-CFU di BCG lux a seguito di infezione in vivo.
In questo esperimento, la virulenza dipendente dalla dose di BCG lux è stata osservata nelle larve di G.mellonella per un periodo di incubazione di 96 ore. La dose letale richiesta per la mortalità larvale del 50% è stata determinata essere una per 10 alla potenza di sette CFU. I gruppi di controllo iniettati con una dose di 10 microliter di PBS-T o quelli semplicemente pungenti che simulano lesioni dell'ago non hanno influenzato la salute larvale o portato a un aumento della mortalità.
Per le larve infettate dal due volte 10 al potere di sette dosi di CFU di BCG lux, la melanizzazione della linea dorsale larvale è stata osservata da 48 ore dopo l'infezione e la melanizzazione sistemica è stata osservata da 96 ore dopo l'infezione. L'infezione da una per 10 alla potenza di sette dosi di CFU di BCG lux ha portato a un declino iniziale della bioluminescenza entro le prime 72 ore dopo l'infezione. Tuttavia, dopo 72 ore dopo l'infezione, la bioluminescenza di BCG lux ha iniziato ad stabilizzarsi, indicando la creazione di infezione persistente.
In questo particolare sistema di infezione, il rapporto in vivo di RLU e CFU variava da 2:1 a 5:1 con una media di 4:1 nel corso di 168 ore. Durante l'iniezione, ricordarsi di fissare le larve in modo che il rischio di sovrapenetrazione sia ridotto al minimo. La puntura accidentale dell'intestino potrebbe portare ad un aumento della mortalità.
Effettuando analisi istopatologiche, è possibile visualizzare l'introduzione di micobatteri con le cellule ospiti. Ulteriori analisi trascritomiche potrebbero rivelare l'interazione a livello genomico. L'uso di questo modello di infezione può consentire il test rapido di nuovi candidati ai farmaci in una fase precoce dello sviluppo, riducendo significativamente il numero di animali utilizzati nello screening farmacologico.
Questo modello di infezione richiede l'uso di una siringa, che può essere associata a lesioni da puntura d'ago. Si consiglia l'uso della nostra tecnica di iniezione per ridurre al minimo tale rischio.
