Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Galleria mellonella als alternatives Infektionsmodell zur Untersuchung der Tuberkulose, wodurch die Anzahl der in der Forschung verwendeten Säugetiermodelle reduziert wird. Im Vergleich zu herkömmlichen Säugetiermodellen wie Mäusen ist Galleria mellonella ein billigeres, ethisch akzeptables und zugänglicheres Modell zur Untersuchung von Tuberkulose. Eine weitere Optimierung dieses Modells wird das Screening der Wirksamkeit und Toxizität von Kandidaten antimykobakteriellen Arzneimitteln ermöglichen und zur Entwicklung dringend benötigter neuartiger Therapeutika für Tuberkulose beitragen.
Galleria mellonella besitzt ein komplexes angeborenes Immunsystem, das mit dem von Säugetieren vergleichbar ist. Die Untersuchung der Wirts-Pathogen-Wechselwirkung kann die Rolle der angeborenen Immunität bei Tuberkulose weiter aufzeigen. Die Verwendung von Galleria mellonella als Infektionsmodell ist nicht auf Tuberkulose beschränkt und wurde in den letzten zehn Jahren häufig für andere bakterielle und Pilzerreger verwendet.
Zunächst entfrosten Sie einen gefrorenen 1,2-Milliliter-Glyzerinbestand von Mycobacterium bovis BCG lux, dem Montrealer Impfstoffstamm, der mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 mit den LuxAB-Genen transformiert wurde. In einem beschrifteten 250-Milliliter-Erlenmeyer-Kolben impfen Sie 15 Milliliter Middlebrook 7H9-Brühe mit einem aufgetauten 1,2-Milliliter-Aliquot von BCG Lux. Legen Sie den Kolben in einen versiegelten Biosicherheitsbehälter und brüten Sie bei 37 Grad Celsius in einem Orbital-Shaker-Inkubator bei 220 U/min für 72 Stunden.
Nach der Inkubation 1:10 Verdünnungen der Kultur in phosphatgepufferter Kochsaline in Luminometerröhren, Wirbel vorbereiten und die Luminometerröhren in das Luminometer laden. Das Substrat 1%n-decylaldehyd in absolutem Ethanol in die Injektorplattform laden und die Biolumineszenz messen. Konvertieren Sie die Biolumineszenz in koloniebildende Einheiten, um das Wachstum der BCG-Luxkultur zu überprüfen.
Übertragen Sie die Kultur auf ein Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 2, 175 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pellet. Entsorgen Sie den Überstand in ein geeignetes Desinfektionsmittel mit bekannter mykobakterizider Aktivität. Waschen Sie das Zellpellet zweimal in 50 Milliliter PBS-T durch Zentrifugieren bei 2, 175 mal g für 10 Minuten, um bakterielle Verklumpung zu verhindern.
Nach der Endwäsche dekantieren Sie den Abfallüberstand und setzen Sie das mykobakterielle Zellpellet im erforderlichen Volumen von PBS-T wieder auf, um die mykobakterielle Suspension auf die gewünschte Zelldichte zu verdünnen. Bereiten Sie dann 10-fache serielle Verdünnungen des Inokulums in 24-Well-Platten mit PBS-T vor. 10 Mikroliter jeder Verdünnung auf Middlebrook 7H11 Agarplatten in Doppelter Ausführung aufteilen, um inokulum CFU-Zahlen aufzuzählen.
Halten Sie die gekauften Instar Larven in der Dunkelheit bei 18 Grad Celsius bei der Ankunft und verwenden Sie innerhalb einer Woche nach dem Kauf. Identifizieren und wählen Sie gesunde Larven für Experimente basierend auf gleichmäßiger Cremefarbe, geeigneter Größe und Gewicht, hoher Beweglichkeit und besitzen die Fähigkeit, sich selbst zu recht, wenn sie umgedreht. Mit stumpfer End-Pinzette die gesunden Larven sorgfältig in eine Petrischale zu zählen, die mit einer Schicht Filterpapier ausgekleidet ist, und bei Raumtemperatur im Dunkeln bis zum Gebrauch aufbewahren.
Bereiten Sie die Injektionsplattform vor, indem Sie ein kreisförmiges Filterpapier mit 94 Millimeterdurchmesser auf eine flache, erhöhte Oberfläche kleben. Aspirieren Sie drei Volumina von 70% Ethanol in eine 25-Mikroliter-Mikrospritze, um sie mit drei Volumen sterilem PBS-T zu sterilisieren, zu entsorgen und weiter zu spülen. Dann setzen Sie das vorbereitete BCG lux inoculum wieder auf und aspirieren 10 Mikroliter in die sterilisierte Mikrospritze.
Verwenden Sie eine separate Spritze, um PBS-T für eine Negative Kontrolle zu aspirieren. Nach 10 Injektionen, setzen Sie das BCG lux Inoculum wieder auf, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten. Verwenden Sie eine Pinzette, um eine Larve aufzunehmen und auf die Injektionsplattform zu legen.
Auf der Plattform, kippen Sie die Larve auf den Rücken und immobilisieren, indem Sie den Kopf und Schwanz mit der Pinzette zu sichern. Suchen Sie das letzte linke Proleg, zählen Sie vom Kopf der Larve herunter und legen Sie die Spitze der Nadel vorsichtig fünf bis sechs Millimeter tief in einem 10 bis 20-Grad-Winkel auf die horizontale Ebene ein. Injizieren Sie das Inokulum aus der Spritze.
Nach jeder Infektion, übertragen Sie die infizierte Larve in eine Petrischale mit einer Schicht Filterpapier ausgekleidet. Eine einzelne 94-Millimeter-Petrischale bietet Platz für bis zu 30 Larven. Bewahren Sie die Petrischale in einer entlüfteten, dunklen Box in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid auf.
Überwachen Sie das Überleben der Larven alle 24 Stunden. Larven gelten als tot, wenn sie sich nicht als Reaktion auf Berührung bewegen. Zeichnen Sie das Überleben auf und bewerten Sie die statistische Signifikanz mit dem Mantel-Cox-Test.
Wählen Sie alle 24 Stunden nach dem Zufallsprinzip fünf infizierte Larven aus und verwenden Sie einen in 70% Ethanol getränkten Wattestäbchen, um die Larvenoberflächen sanft zu sterilisieren. Die Larven einzeln in zwei Milliliter Lysing-Matrixröhren mit 800 Mikrolitersterilen PBS. Dann verwenden Sie einen Homogenisator, um die Larven für 60 Sekunden bei sechs Metern pro Sekunde zu homogenisieren.
Zentrifugieren Sie die Lysing-Rohre bei 3, 500 mal g für fünf Sekunden, um das Homogenat von den Deckeln zu entfernen und das Homogenat sorgfältig einzeln in fünf sterile Luminometer-Röhren zu dekannieren. Reserve 100 Mikroliter Homogenat in einem sterilen 1,5-Milliliter-Reaktionsrohr. Stellen Sie alle verbleibenden Homogenate wieder her, indem Sie die Lysing-Matrixröhren mit einem Milliliter PBS-T und Pipette in die entsprechenden Luminometer-Röhren waschen.
Wirbeln Sie die Luminometerröhren und messen Sie die Biolumineszenz der Homogenate auf einem Luminometer. Bereiten Sie dann 10-fache serielle Verdünnungen der reservierten 100 Mikroliter Homogenat in 24-Well-Kulturplatten mit PBS-T vor. 10 Mikroliter der Verdünnung auf jede Middlebrook 7H11 Agarplatte pipette und mit einem sterilen Plattenstreuer aufverbreiten.
Zwei Wochen lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach zählen Kolonie-bildende Einheiten. Bestimmen Sie das RLU-Zu-KBE-Verhältnis von BCG Lux nach in vivo-Infektion.
In diesem Experiment wurde BCG Lux dosisabhängige Virulenz bei G.mellonella Larven über eine 96-stündige Inkubationszeit beobachtet. Die tödliche Dosis, die für die Sterblichkeit von 50% Larven erforderlich ist, wurde als ein mal 10 bis zur Leistung von sieben KBE bestimmt. Kontrollgruppen, die mit einer 10-Mikroliter-Dosis VON PBS-T injiziert wurden, oder solche, die einfach simulierte Nadelverletzungen gestochen haben, hatten keinen Einfluss auf die Gesundheit der Larven oder führten zu einer Erhöhung der Sterblichkeit.
Bei Larven, die mit der zweifachen 10-KBE-Dosis von BCG Lux infiziert waren, wurde die Melanisierung der Larven-Rückenlinie ab 48 Stunden nach der Infektion beobachtet und die systemische Melanisierung wurde ab 96 Stunden nach der Infektion beobachtet. Eine Infektion mit einer einmaligen 10 auf die Leistung von sieben KBE-Dosis von BCG Lux führte zu einem anfänglichen Rückgang der Biolumineszenz innerhalb der ersten 72 Stunden nach der Infektion. Jedoch, nach 72 Stunden nach der Infektion, die Biolumineszenz von BCG Lux begann Plateau, was auf die Etablierung einer anhaltenden Infektion.
In diesem speziellen Infektionssystem lag das In-vivo-Verhältnis von RLU und CFU zwischen 2:1 und 5:1 mit einem Durchschnitt von 4:1 über den 168-Stunden-Zeitkurs. Denken Sie während der Injektion daran, die Larven zu sichern, so dass das Risiko einer Überdringung minimiert wird. Eine versehentliche Punktion des Darms kann zu einer erhöhten Sterblichkeit führen.
Durch histopathologische Analysen kann die Einführung von Mykobakterien mit den Wirtszellen visualisiert werden. Weitere transkriptomische Analysen könnten die Wechselwirkung auf genomischer Ebene aufdecken. Die Verwendung dieses Infektionsmodells kann die schnelle Prüfung neuartiger Arzneimittelkandidaten in einem frühen Entwicklungsstadium ermöglichen, wodurch die Zahl der Tiere, die bei Medikamentenscreenings verwendet werden, deutlich reduziert wird.
Dieses Infektionsmodell erfordert die Verwendung einer Spritze, die mit Nadelstichverletzungen in Verbindung gebracht werden kann. Wir empfehlen den Einsatz unserer Injektionstechnik, um ein solches Risiko zu minimieren.
