Nuestro protocolo proporciona un enfoque simple pero robusto para identificar y caracterizar los mecanismos competitivos entre diferentes cepas de bacterias Vibrio fischeri. Este método utiliza plásmidos estables que codifican diferentes genes de resistencia a los antibióticos y proteínas fluorescentes que permiten la selección diferencial y la discriminación visual de cada cepa bacteriana en un cultivo mixto. Para comenzar, utilice un palillo de dientes estéril para raspar las células de la placa de agar en el tamaño de un grano de arroz.
Resuspender las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de caldo LBS. Para descomponer los grumos de la célula, presionelos en el lado del tubo y luego pipetee hacia arriba y hacia abajo vigorosamente. Cierre el tubo y el vórtice durante uno o dos segundos y repita si los grumos de la célula siguen siendo visibles hasta que la muestra sea visualmente uniforme.
Repita estos pasos de preparación desde el raspado de celdas hasta el vórtice para todas las muestras. Mida y registre la densidad óptica en 600 nanómetros para todas las muestras. Para obtener una medición precisa de la DO, diluya las muestras hasta 10 veces utilizando caldo LBS.
A continuación, normalice cada muestra al OD 600 deseado. Para mezclar la cepa de referencia y la cepa de la competencia en una proporción de uno a uno, añada 100 microlitros de cada cepa normalizados a OD 1.0 a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros etiquetado y vórtice durante uno a dos segundos. Como control, mezcle la cepa de referencia con una versión etiquetada diferencialmente de sí misma y vórtice también.
Es fundamental lograr la relación de inicio correcta, ya que puede cambiar considerablemente el resultado del experimento. Para asegurar el éxito, este paso puede requerir optimización para una especie bacteriana determinada. Después de repetir este paso para cada réplica biológica, debe haber cuatro réplicas biológicas con cepas de referencia etiquetadas diferencialmente como controles y cuatro réplicas biológicas con referencia etiquetada diferencialmente y cepas de la competencia.
Para hacer manchas de cultivo que se utilizarán para la microscopía de fluorescencia después de la incubación, agregue 10 microlitros de cada control y mezcla experimental en una placa de Petri que contenga agar LBS. Después de que las manchas se hayan secado completamente en el banco, incubar las placas a 24 grados centígrados durante 24 horas. Para hacer manchas de cultivo que se utilizarán para cuantificar las unidades formadoras de colonias para cada cepa al final del experimento, agregue 10 microlitros de cada control y mezclas experimentales en 24 placas de pozo que contengan un mililitro de agar LBS por pozo.
Después de que las manchas se hayan secado por completo, incubar las placas a 24 grados centígrados durante cinco horas. Para realizar una dilución en serie de mezclas de coincubation iniciales, gire una placa de 96 pozos de 90 grados para que haya ocho columnas y 12 filas. Etiquete cada fila con el ID de deformación unitaria, el número de réplica y la hora que comienza con t cero.
Etiquetar las placas de agar LBS suplementadas con el antibiótico adecuado en el que detectar la serie de dilución mientras se asegura de identificar para qué cepa está seleccionando cada placa antibiótica. Con una pipeta multicanal, agregue 180 microlitros de caldo LBS a cada pozo dejando la primera columna vacía para la mezcla de coincubation sin diluir. Usando una pipeta de microlitros de un solo canal, transfiera 100 microlitros de la mezcla de coincubation desde el tubo al primer pozo de la primera columna, luego deseche la punta y repita para todas las mezclas de coincubation.
Con una pipeta multicanal, transfiera 20 microlitros de la columna uno a la columna dos y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Deseche las puntas y repita para cada columna mientras es consistente con el número de pipeteo hacia arriba y hacia abajo para cada dilución. Al final, cada fila contendrá una dilución en serie de 10 veces de la mezcla inicial.
Utilice una pipeta multicanal equipada con ocho puntas para aspirar cinco microlitros de cada pozo en una serie de dilución y detectar en la placa de agar LBS suplementada con Kanamicina que selecciona para la cepa de referencia. Repita este paso para seleccionar la detección de tensión de la competencia en la placa suplementada con cloramphenicol. Después de que las manchas se hayan secado por completo, coloque las placas en la incubadora a 24 grados centígrados.
Después de que las manchas de coincubation y las 24 placas de pozo se hayan incubado durante cinco horas a 24 grados Centígrados, agregue un mililitro de caldo LBS a cada pozo. Resuspend por pipeteo hacia arriba y hacia abajo hasta que todas las células se han resuspendido siendo consistentes con el vigor en el que las células se resuspenden en todas las réplicas. Una vez que se resuspendiga cada punto de coincubación, prepare una placa de 96 pozos para una dilución en serie y placas de agar LBS con los antibióticos adecuados en los que detectar la dilución de la misma manera que se hizo anteriormente.
Para completar la dilución en serie para las mediciones finales en las 24 placas de pozo, realice los pasos utilizados para la dilución en serie del inóculo inicial y detecte cada dilución en placas de agar LBS como se hizo anteriormente. Continúe con la imagen de las manchas de coincubation en las placas de Petri y el análisis de datos como se describe en el manuscrito. En el tratamiento experimental, la cepa de referencia y la cepa de la competencia una están presentes en una proporción de 0,5 al principio y al final del experimento consistente con el tratamiento de control.
Los valores de log RCI no eran estadísticamente diferentes de cero para el tratamiento de control o cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa de la competencia uno. Estos datos sugieren que no existía competencia entre la cepa de referencia y la cepa de la competencia. Por el contrario, cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa de la competencia dos, la cepa de referencia disminuyó de una proporción de 0,5 al principio a una proporción inferior a 0,01 al final del experimento.
Además, los valores de RCI de registro fueron significativamente mayores que cero cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa de la competencia dos. En conjunto, estos datos indican que la proporción de la cepa de referencia disminuyó en presencia de la cepa de la competencia dos que sugieren la competencia entre las cepas. Cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa de la competencia, las UFC de ambas cepas aumentaron en el transcurso de cinco horas y no fueron significativamente diferentes, lo que sugiere que no se produjo ninguna competencia.
Además, se observó aproximadamente 3200% de recuperación que no era estadísticamente diferente del control. Sin embargo, cuando la cepa de referencia se incubaba con dos cepas de la competencia, las FFU de cepa de referencia eran significativamente más bajas que las de tensión dos UFC en el control a cinco horas. Además, se observó aproximadamente un 4% de recuperación significativamente menor que el control.
En conjunto, estos datos indican que la cepa dos compitió la cepa de referencia matando a sus células. El paso más importante en este procedimiento es lograr la relación de inicio correcta, ya que puede afectar significativamente a los resultados.
