הפרוטוקול שלנו מספק גישה פשוטה אך איתנה לזיהוי ואפיון מנגנונים תחרותיים בין זנים שונים של חיידקי Vibrio fischeri. שיטה זו משתמשת בפלסמידים יציבים המקודדים גנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלואורסצנטיים המאפשרים בחירה דיפרנציאלית ואפליה חזותית של כל זן חיידקי בתרבות מעורבת. כדי להתחיל, להשתמש קיסם סטרילי כדי לגרד את התאים מצלחת אגר בגודל של גרגר אורז.
תן שימוש חוזר בתאים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של מרק LBS. כדי לשבור את גושי התאים, לחץ עליהם לצד הצינור ולאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה במרץ. סגור את הצינור והמערבולת למשך דקה עד שתי שניות וחזור על הפעולה אם גושי התאים עדיין גלויים עד שהדגימה אחידה מבחינה חזותית.
חזור על שלבי הכנה אלה מגרד תאים למערבולת עבור כל הדגימות. למדוד ולתזמן את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר עבור כל הדגימות. כדי להשיג מדידת OD מדויקת, לדלל את הדגימות עד פי 10 באמצעות מרק LBS.
לאחר מכן לנרמל כל מדגם OD 600 הרצוי. כדי לערבב את זן הייחוס ואת זן המתחרה ביחס של אחד לאחד, הוסף 100 מיקרוליטרים של כל זן מנורמל ל- OD 1.0 לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ומערבולת למשך דקה עד שתי שניות. כפקד, מערבבים את זן הייחוס עם גרסה מתויגת באופן דיפרנציאלי של עצמו ומערבולת גם כן.
זה קריטי כדי להשיג את יחס ההתחלה הנכון כפי שהוא יכול לשנות במידה ניכרת את התוצאה של הניסוי. כדי להבטיח הצלחה, צעד זה עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מין חיידקי נתון. לאחר חזרה על שלב זה עבור כל שכפול ביולוגי, צריכים להיות ארבעה שכפולים ביולוגיים עם זנים התייחסות מתויגים באופן דיפרנציאלי כמו פקדים וארבעה שכפולים ביולוגיים עם התייחסות מתויגת דיפרנציאלית וזנים מתחרים.
כדי ליצור כתמי תרבות שישמשו למיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר הדגירה, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של כל פקד ותערובת ניסיונית על צלחת פטרי המכילה אגר LBS. לאחר שהנקודות התייבשו לחלוטין על הספסל, הדגירה את הצלחות ב 24 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. כדי להפוך כתמי תרבות שישמש לכימות המושבה להרכיב יחידות עבור כל זן בסוף הניסוי, להוסיף 10 microliters של כל שליטה תערובות ניסיוני לתוך 24 צלחות גם המכיל מיליליטר אחד של אגר LBS לגם.
לאחר שהנקודות התייבשו לחלוטין, הדגירה את הצלחות ב 24 מעלות צלזיוס במשך חמש שעות. כדי לבצע דילול סדרתי של תערובות מטבע התחלתיות, סובב צלחת 96 בארות ב- 90 מעלות כך שיהיו שמונה עמודות ו- 12 שורות. סמן כל שורה בתווית עם מזהה המתח, מספר השכפול והשעה המתחילה באפס t.
סמן את צלחות אגר LBS בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה שבו לזהות את סדרת דילול תוך הקפדה לזהות איזה זן כל צלחת אנטיביוטית בוחרת. עם פיפטה מרובת ערוצים, הוסיפו 180 מיקרוליטרים של מרק LBS לכל באר והשאירו את העמודה הראשונה ריקה לתערובת המטבעות הלא מזוהה. באמצעות פיפטה ערוץ יחיד 200 מיקרוליטר, להעביר 100 microliters של תערובת coincubation מן הצינור לתוך הטוב הראשון של העמודה הראשונה, ולאחר מכן להשליך את הקצה ולחזור על כל תערובות מטבע.
עם פיפטה מרובת ערוצים, העבר 20 מיקרוליטרים מעמודה אחת לעמודה 2 ו- pipette למעלה ולמטה כדי לערבב. השלך את העצות וחזור על כל עמודה תוך שמירה על עקביות עם מספר הצינורות למעלה ולמטה עבור כל דילול. עד הסוף, כל שורה תכיל דילול סדרתי של התערובת הראשונית פי 10.
השתמש פיפטה רב ערוצי מצויד שמונה טיפים כדי לשאיף חמישה microliters מכל באר בסדרת דילול נקודה על צלחת אגר LBS בתוספת Kanamycin שבוחר עבור זן הייחוס. חזור על שלב זה כדי לבחור עבור המתח המתחרה איתור על צלחת משלימה Chloramphenicol. לאחר שהנקודות התייבשו לחלוטין, מניחים את הצלחות באינקובטור ב 24 מעלות צלזיוס.
לאחר כתמי המטבע ו -24 צלחות באר כבר דגירה במשך חמש שעות ב 24 מעלות צלזיוס, להוסיף מיליליטר אחד של מרק LBS לכל באר. התן מחדש על-ידי צינור למעלה ולמטה עד שכל התאים יתווספו מחדש בהתאם למרץ שבו התאים יתווספו מחדש על-פני כל השכפולים. לאחר כל נקודה coincubation הוא resuspended, להכין צלחת 96 גם עבור דילול סדרתי צלחות אגר LBS עם אנטיביוטיקה המתאימה שבו לזהות את הדילול באותו אופן כמו שנעשה בעבר.
כדי להשלים את הדילול הסדרתי עבור מדידות t סופיות ב 24 צלחות באר, לבצע שלבים המשמשים לדילול סדרתי של inoculum ההתחלה ולמקום כל דילול על צלחות אגר LBS כפי שנעשה בעבר. המשך בהדמיית כתמי המטבע על לוחות פטרי וניתוח נתונים כמתואר בכתב היד. בטיפול הניסיוני, זן הייחוס והמתחרה נמצאים בשיעור של 0.5 בתחילת הניסוי ובסוףו בהתאם לטיפול הבקרה.
ערכי יומן RCI לא היו שונים סטטיסטית מאפס לטיפול הבקרה או כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן מתחרה אחד. נתונים אלה מצביעים על כך שלא הייתה תחרות בין זן הייחוס למתח המתחרה. לעומת זאת, כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן המתחרה 2, זן הייחוס ירד משיעור של 0.5 בהתחלה לחלק פחות מ 0.01 בסוף הניסוי.
יתר על כן, ערכי RCI יומן היו גדולים משמעותית מאפס כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן מתחרה 2. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך ששיעור זן הייחוס ירד בנוכחות זן מתחרה שני המצביע על תחרות בין הזנים. כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן מתחרה אחד, CFUs של שני הזנים גדל במהלך חמש שעות ולא היו שונים באופן משמעותי רומז כי לא התרחשה תחרות.
כמו כן, נצפתה התאוששות של כ-3200%, שלא הייתה שונה סטטיסטית מהבקרה. עם זאת, כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן המתחרה 2, CFUs זן התייחסות היו נמוכים באופן משמעותי מאשר זן שני CFUs בפקד בחמש שעות. כמו כן, כ-4% התאוששות נצפתה נמוכה משמעותית מהבקרה.
בסך הכל, נתונים אלה מצביעים על כך שזן 2 החוצה התחרה זן הייחוס על ידי הריגת התאים שלה. הצעד החשוב ביותר בהליך זה הוא השגת יחס ההתחלה הנכון כפי שהוא יכול להשפיע באופן משמעותי על התוצאות.
