Il nostro protocollo fornisce un approccio semplice ma robusto per identificare e caratterizzare i meccanismi competitivi tra i diversi ceppi di batteri Vibrio fischeri. Questo metodo utilizza plasmidi stabili che codificano diversi geni di resistenza agli antibiotici e proteine fluorescenti che consentono la selezione differenziale e la discriminazione visiva di ogni ceppo batterico in una coltura mista. Per iniziare, utilizzare uno stuzzicadenti sterile per raschiare le cellule dalla piastra di agar delle dimensioni di un chicco di riso.
Rimescolare le cellule in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente un millilitro di brodo LBS. Per rompere i grumi cellulari, premerli sul lato del tubo e poi pipettare su e giù vigorosamente. Chiudere il tubo e il vortice per uno o due secondi e ripetere se i grumi cellulari sono ancora visibili fino a quando il campione non è visivamente uniforme.
Ripetere questi passaggi di preparazione dalla raschiatura cellulare al vortice per tutti i campioni. Misurare e registrare la densità ottica a 600 nanometri per tutti i campioni. Per ottenere una misurazione accurata dell'OD, diluire i campioni fino a 10 volte utilizzando brodo LBS.
Quindi normalizzare ogni campione con l'OD 600 desiderato. Per mescolare la deformazione di riferimento e la tensione concorrente in un rapporto uno a uno, aggiungere 100 microlitri di ogni deformazione normalizzati a OD 1.0 a un tubo di centrifuga e vortice etichettato da 1,5 millilitri per uno o due secondi. Come controllo, mescolare la deformazione di riferimento con una versione con tag differenziale di se stessa e del vortice.
È fondamentale ottenere il giusto rapporto di partenza in quanto può cambiare considerevolmente l'esito dell'esperimento. Per garantire il successo, questo passaggio potrebbe richiedere l'ottimizzazione per una determinata specie batterica. Dopo aver ripetuto questo passaggio per ogni replica biologica, dovrebbero esserci quattro repliche biologiche con ceppi di riferimento etichettati in modo differenziato come controlli e quattro repliche biologiche con riferimento taggato differenzialmente e ceppi concorrenti.
Per creare punti di coltura che verranno utilizzati per la microscopia a fluorescenza dopo l'incubazione, aggiungere 10 microlitri di ogni controllo e miscela sperimentale su una piastra di Petri contenente agar LBS. Dopo che le macchie si sono completamente asciugate sulla panchina, incubare le piastre a 24 gradi Celsius per 24 ore. Per creare punti di coltura che verranno utilizzati per quantificare le unità di formatura della colonia per ogni ceppo alla fine dell'esperimento, aggiungere 10 microlitri di ogni controllo e miscele sperimentali in 24 piastre di pozzo contenenti un millilitro di agar LBS per pozzo.
Dopo che le macchie si sono completamente asciugate, incubare le piastre a 24 gradi Celsius per cinque ore. Per eseguire una diluizione seriale delle miscele di coincubazione iniziale, ruotare una piastra di pozzo 96 di 90 gradi in modo che ci siano otto colonne e 12 righe. Etichettare ogni riga con l'ID ceppo, il numero di replica e l'ora che inizia con t zero.
Etichettare le piastre di agar LBS integrate con l'antibiotico appropriato su cui individuare la serie di diluizione assicurandosi di identificare per quale ceppo sta selezionando ogni piastra antibiotica. Con una pipetta multicanale, aggiungere 180 microlitri di brodo LBS ad ogni pozzo lasciando vuota la prima colonna per la miscela di cocubazione non diluita. Utilizzando una pipetta a canale singolo da 200 microlitri, trasferire 100 microlitri della miscela di coincubazione dal tubo al primo pozzo della prima colonna, quindi scartare la punta e ripetere per tutte le miscele di coincubazione.
Con una pipetta multicanale, trasferire 20 microlitri dalla colonna uno alla colonna due e pipettare su e giù per mescolare. Scartare le punte e ripetere per ogni colonna pur essendo coerenti con il numero di tubazioni su e giù per ogni diluizione. Alla fine, ogni riga conterrà una diluizione seriale di 10 volte della miscela iniziale.
Utilizzare una pipetta multicanale dotata di otto punte per aspirare cinque microlitri da ciascun pozzo in una serie di diluizione e individuare sulla piastra di agar LBS integrata Kanamycin che seleziona per la deformazione di riferimento. Ripetere questo passaggio per selezionare il ceppo concorrente che si trova sulla piastra integrata Chloramphenicol. Dopo che le macchie si sono asciugate completamente, posizionare i piatti nell'incubatrice a 24 gradi Celsius.
Dopo che le macchie di coincubazione e le 24 piastre del pozzo sono state incubate per cinque ore a 24 gradi Celsius, aggiungere un millilitro di brodo LBS ad ogni pozzo. Resuspend pipettando su e giù fino a quando tutte le celle non sono state rimonite essendo coerenti con il vigore in cui le celle vengono rimescolate in tutte le repliche. Una volta che ogni punto di coincubazione viene rimostrato, preparare una piastra di pozzo 96 per una diluizione seriale e piastre di agar LBS con gli antibiotici appropriati su cui individuare la diluizione nello stesso modo precedentemente fatto.
Per completare la diluizione seriale per le misurazioni finali nelle 24 piastre del pozzo, eseguire i passaggi utilizzati per la diluizione seriale dell'inoculo iniziale e individuare ogni diluizione sulle piastre di agar LBS come fatto in precedenza. Procedere con l'imaging delle macchie di coincubazione sulle piastre di Petri e l'analisi dei dati come descritto nel manoscritto. Nel trattamento sperimentale, il ceppo di riferimento e il ceppo concorrente uno sono presenti in una proporzione di 0,5 all'inizio e alla fine dell'esperimento coerente con il trattamento di controllo.
I valori log RCI non erano statisticamente diversi da zero per il trattamento di controllo o quando il ceppo di riferimento è stato incubato con il ceppo concorrente uno. Questi dati indicano che non vi era concorrenza tra il ceppo di riferimento e quello del ceppo concorrente. Per contro, quando il ceppo di riferimento è stato incubato con ceppo concorrente due, il ceppo di riferimento è sceso da una proporzione di 0,5 all'inizio ad una proporzione inferiore a 0,01 alla fine dell'esperimento.
Inoltre, i valori di log RCI erano significativamente maggiori di zero quando il ceppo di riferimento è stato incubato con il ceppo due concorrente. Insieme, questi dati indicano che la proporzione del ceppo di riferimento è diminuita in presenza di ceppi concorrenti due che suggeriscono la concorrenza tra i ceppi. Quando il ceppo di riferimento è stato incubato con il ceppo concorrente uno, i CFC di entrambi i ceppi sono aumentati nel corso di cinque ore e non erano significativamente diversi, il che suggerisce che non si è verificata alcuna concorrenza.
Inoltre, è stato osservato un recupero di circa il 3200%, che non era statisticamente diverso dal controllo. Tuttavia, quando il ceppo di riferimento è stato incubato con ceppo concorrente due, i CFC del ceppo di riferimento erano significativamente inferiori al ceppo di due CFC nel controllo a cinque ore. Inoltre, è stato osservato un recupero di circa il 4% significativamente inferiore al controllo.
Complessivamente, questi dati indicano che il ceppo due fuori competeva con il ceppo di riferimento uccidendo le sue cellule. Il passo più importante in questa procedura è ottenere il giusto rapporto di partenza in quanto può influire in modo significativo sui risultati.
