بروتوكول لدينا يوفر نهجا بسيطا ولكن قوية لتحديد وتوصيف الآليات التنافسية بين سلالات مختلفة من البكتيريا فيبريو fischeri. تستخدم هذه الطريقة البلازميدات المستقرة التي تشفّر جينات مقاومة المضادات الحيوية المختلفة والبروتينات الفلورية التي تسمح بالاختيار التفاضلي والتمييز البصري لكل سلالة بكتيرية في ثقافة مختلطة. للبدء ، استخدم مسواك معقمة لكشط الخلايا من صفيحة أجار في حجم حبة الأرز.
Resuspend الخلايا في أنبوب 1.5 ملليلتر microcentuge التي تحتوي على ملليلتر واحد من مرق LBS. لتفريق كتل الخلية، اضغط عليها في جانب الأنبوب ومن ثم ماصة صعودا وهبوطا بقوة. أغلق الأنبوب ودوامة لمدة ثانية إلى ثانيتين وكرر إذا كانت كتل الخلية لا تزال مرئية حتى تكون العينة موحدة بصرياً.
كرر خطوات التحضير هذه من كشط الخلايا إلى الدوامة لجميع العينات. قياس وتسجيل الكثافة البصرية في 600 نانومتر لجميع العينات. للحصول على قياس دقيق لـ OD، قم بتخفيف العينات حتى 10 أضعاف باستخدام مرق LBS.
ثم تطبيع كل عينة إلى OD المطلوب 600. لخلط سلالة مرجعية وسلالات منافس في نسبة واحد إلى واحد، إضافة 100 ميكرولترات من كل سلالة تطبيعها إلى OD 1.0 إلى 1.5 ملليلتر المسمى أنبوب الطرد المركزي ودوامة لمدة ثانية إلى ثانيتين. كتحكم، اخلطي السلالة المرجعية مع نسخة مُوسومة من نفسها و دوامة أيضاً.
ومن الأهمية بمكان تحقيق نسبة البداية الصحيحة لأنها يمكن أن تغير إلى حد كبير نتيجة التجربة. لضمان النجاح، قد تتطلب هذه الخطوة تحسين الأنواع البكتيرية معينة. وبعد تكرار هذه الخطوة لكل تكرار بيولوجي، ينبغي أن تكون هناك أربع نسخ بيولوجية متماثلة مع سلالات مرجعية مُوسَّمة بشكل تفاضلي كضوابط وأربعة سلالات بيولوجية مع سلالات مرجعية ومنافسة ذات علامات تفاضلية.
لجعل البقع الثقافة التي سيتم استخدامها للمجهر الفلوريسنس بعد الحضانة، إضافة 10 ميكرولترات من كل عنصر تحكم والخليط التجريبي على لوحة بيتري التي تحتوي على LBS أجار. بعد أن جفت البقع تماما على مقاعد البدلاء، احتضان لوحات في 24 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لجعل البقع الثقافة التي سيتم استخدامها لتحديد وحدات تشكيل مستعمرة لكل سلالة في نهاية التجربة، إضافة 10 ميكرولترات من كل عنصر تحكم والمخاليط التجريبية في 24 لوحات البئر التي تحتوي على ملليلتر واحد من LBS أجار في البئر.
بعد أن جفت البقع تماما، احتضان لوحات في 24 درجة مئوية لمدة خمس ساعات. لتنفيذ تخفيف تسلسلي من بدء خلطات العملة، تدوير 96 لوحة جيدا 90 درجة حتى لا يكون هناك ثمانية أعمدة و 12 الصفوف. تسمية كل صف مع معرف سلالة، رقم النسخ المتماثل، والوقت بدءاً من t صفر.
تسمية لوحات Agar LBS تكملها بالمضادات الحيوية المناسبة التي على الفور سلسلة التخفيف مع التأكد من تحديد أي سلالة كل لوحة المضادات الحيوية يتم اختيار ل. مع ماصة متعددة القنوات، إضافة 180 ميكروليت من مرق LBS إلى كل بئر ترك العمود الأول فارغة لخليط عمله غير مخفف. باستخدام ماصة قناة واحدة 200 ميكرولتر، نقل 100 ميكرولترات من خليط عمله من الأنبوب إلى البئر الأولى من العمود الأول، ثم تجاهل طرف وكرر لجميع خلطات العملة.
مع ماصة متعددة القنوات، نقل 20 ميكرولترات من العمود الأول إلى عمود اثنين وماصة صعودا وهبوطا لخلط. تجاهل النصائح وكرر لكل عمود في حين يجري متسقة مع عدد من الأنابيب صعودا وهبوطا لكل تخفيف. في النهاية، كل صف سوف تحتوي على تخفيف المسلسل 10 أضعاف من الخليط الأولي.
استخدام ماصة متعددة القنوات مزودة ثماني نصائح لpirate خمسة ميكروليترس من كل بئر في سلسلة التخفيف وبقعة على لوحة LBS agar الملحقة LBS التي تحدد للذرة المرجعية. كرر هذه الخطوة لتحديد سلالات منافس اكتشاف على لوحة المكملة كلورافينيكول. بعد أن جفت البقع تماما، ضع لوحات في الحاضنة في 24 درجة مئوية.
بعد بقع التراكم المعدنية ولوحات 24 جيدا قد احتضنت لمدة خمس ساعات في 24 درجة مئوية، إضافة ملليلتر واحد من مرق LBS إلى كل بئر. Resuspend بواسطة pipetting صعودا وهبوطا حتى تم resuspended جميع الخلايا كونها متسقة مع النشاط الذي يتم إعادة تعليق الخلايا عبر جميع النسخ المتماثل. مرة واحدة يتم إعادة تعليق كل بقعة coincubation، وإعداد لوحة 96 جيدا لتخفيف المسلسل وألواح أجار LBS مع المضادات الحيوية المناسبة التي على الفور التخفيف بنفس الطريقة كما فعلت سابقا.
لإكمال التخفيف التسلسلي للقياسات النهائية t في 24 ألواح البئر، تنفيذ الخطوات المستخدمة لتخفيف المسلسل من inoculum البداية وبقعة كل تخفيف على لوحات Agar LBS كما فعلت سابقا. المضي قدما في تصوير بقع النتوء على لوحات بيتري وتحليل البيانات كما هو موضح في المخطوطة. في المعالجة تجريبيّة, ال [ا لّورّدّيّددد], واحدة موجودة في نسبة من 0.5 في البداية ونهاية من التجربة متّسقة مع التحكم معالجة.
لم تكن قيم RCI للسجل مختلفة إحصائياً عن الصفر لمعالجة التحكم أو عندما تم احتضان السلالة المرجعية مع سلالة المنافس واحد. وتشير هذه البيانات إلى أنه لم تكن هناك منافسة بين السلالة المرجعية والضغط المنافس واحد. وعلى النقيض من ذلك، عندما كانت السلالة المرجعية محتضنة بسلالات المنافسين الثانية، انخفضت السلالة المرجعية من نسبة 0.5 في البداية إلى نسبة أقل من 0.01 في نهاية التجربة.
وعلاوة على ذلك، كانت قيم السجل RCI أكبر بكثير من الصفر عندما تم احتضان السلالة المرجعية مع سلالة المنافسين اثنين. وتشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن نسبة السلالة المرجعية انخفضت في وجود إجهاد منافسين اثنين مما يشير إلى وجود منافسة بين السلالات. عندما تم احتضان السلالة المرجعية مع سلالة المنافس الأول ، زادت وحدات CFUs من كل من السلالات على مدار خمس ساعات ولم تكن مختلفة بشكل كبير مما يشير إلى أنه لم تحدث منافسة.
أيضا, تقريبا 3200٪ لوحظت الانتعاش الذي لم يكن مختلفا إحصائيا عن عنصر التحكم. ومع ذلك، عندما تم احتضان سلالة مرجعية مع سلالة المنافس الثاني، سلالة المرجعية CFUs كانت أقل بكثير من سلالة اثنين من وحدات CFUs في السيطرة في خمس ساعات. أيضا، لوحظت تقريبا 4٪ انتعاش بشكل ملحوظ أقل من عنصر التحكم.
وإجمالاً، تشير هذه البيانات إلى أن سلالة اثنين من أصل تنافست السلالة المرجعية عن طريق قتل خلاياها. الخطوة الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو تحقيق نسبة البداية الصحيحة لأنها يمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتائج.
