Наш протокол обеспечивает простой, но надежный подход к выявлению и характеристике конкурентных механизмов между различными штаммами бактерий Vibrio fischeri. Этот метод использует стабильные плазмиды, которые кодируют различные гены устойчивости к антибиотикам и флуоресцентные белки, которые позволяют дифференциальный отбор и визуальную дискриминацию каждого бактериального штамма в смешанной культуре. Для начала используйте стерильную зубочистку, чтобы соскребать клетки с агарной пластины размером с рисовое зерно.
Повторное содержание клеток в 1,5 миллилитровой микроцентрифуге, содержащей один миллилитр бульона LBS. Чтобы разбить клеточные сгустки, нажмите их в сторону трубки, а затем пипетки вверх и вниз энергично. Закройте трубку и вихрь на одну-две секунды и повторите, если скопления клеток все еще видны до тех пор, пока образец визуально не будет однородным.
Повторите эти шаги подготовки от соскабливания клеток до вихрей для всех образцов. Измерьте и замитьте оптическую плотность на 600 нанометров для всех образцов. Чтобы получить точное измерение OD, разбавить образцы до 10 раз с помощью бульона LBS.
Затем нормализует каждый образец до желаемого OD 600. Чтобы смешать эталонный штамм и штамм конкурента в соотношении один к одному, добавьте 100 микролитров каждого штамма, нормализованных до OD 1.0, к помеченной 1,5 миллилитрированной центрифуге трубки и вихря в течение одной-двух секунд. В качестве контроля смешайте эталонный штамм с дифференциально помеченной версией себя и вихря.
Очень важно достичь правильного исходного соотношения, поскольку оно может значительно изменить результат эксперимента. Чтобы обеспечить успех, этот шаг может потребовать оптимизации для данного бактериального вида. После повторения этого шага для каждого биологического репликации, должно быть четыре биологических репликаций с дифференциально помечены эталонные штаммы в качестве элементов управления и четыре биологических репликаций с дифференциально помечены ссылки и конкурента штаммов.
Чтобы сделать культурные пятна, которые будут использоваться для флуоресценции микроскопии после инкубации, добавить 10 микролитров каждого управления и экспериментальной смеси на пластину Петри, содержащую LBS агар. После того, как пятна полностью высохли на скамейке, инкубировать пластины при 24 градусах по Цельсию в течение 24 часов. Чтобы сделать культурные пятна, которые будут использоваться для количественной оценки единиц формирования колонии для каждого штамма в конце эксперимента, добавьте 10 микролитров каждого управления и экспериментальных смесей в 24 пластины, содержащие один миллилитр LBS агара на колодец.
После того, как пятна полностью высохли, инкубировать пластины при 24 градусах по Цельсию в течение пяти часов. Для выполнения последовательного разбавления стартовых смесей coincubation, поверните 96 хорошо пластины 90 градусов, так что есть восемь столбцов и 12 строк. Наклейте этикетку на каждую строку с идентификатором деформации, номером репликации и временем, начинающимся с t zero.
Этикетка LBS агар пластины дополнены соответствующим антибиотиком, на котором обнаружить серию разбавления, убедившись, чтобы определить, какой штамм каждой пластины антибиотиков выбирает для. С многоканарной пипеткой добавьте 180 микролитров бульона LBS к каждому колодец, оставляя первую колонку пустой для неразбавленной смеси coincubation. Используя 200 микролитера одноканарной пипетки, перенесите 100 микролитров смеси чеканки из трубки в первую колодец первой колонки, затем отбросьте наконечник и повторите для всех смесей coincubation.
С многоканарной пипеткой, передача 20 микролитров от столбца один к столбу два и пипетки вверх и вниз, чтобы смешать. Откажитесь от наконечников и повторите для каждой колонки, в то время как в соответствии с числом трубопроводов вверх и вниз для каждого разбавления. В конце концов, каждый ряд будет содержать 10-кратное серийное разбавление начальной смеси.
Используйте многоканарновые пипетки оснащены восемью советами, чтобы аспирировать пять микролитров из каждой хорошо в серии разбавления и пятно на Kanamycin дополнен LBS агар пластины, которая выбирает для эталонного штамма. Повторите этот шаг, чтобы выбрать для конкурента штамма пятнистость на Chloramphenicol дополненной пластины. После того, как пятна полностью высохли, поместите пластины в инкубатор при 24 градусах по Цельсию.
После coincubation пятна и 24 хорошо пластины были инкубированы в течение пяти часов при 24 градусов по Цельсию, добавить один миллилитр бульона LBS к каждому хорошо. Resuspend путем pipetting вверх и вниз до тех пор пока все клетки не будут resuspended в соответствии с силой в которой клетки resuspended через все репликации. После того, как каждое место coincubation повторно, подготовить 96 хорошо пластины для серийного разбавления и LBS агар пластин с соответствующими антибиотиками, на которых обнаружить разбавления таким же образом, как это было сделано ранее.
Для завершения серийного разбавления для т окончательных измерений в 24 пластины хорошо, выполнить шаги, используемые для последовательного разбавления стартового инокулума и месте каждого разбавления на пластинах LBS агара, как это было сделано ранее. Продолжить визуализацию пятен монет на пластинах Петри и анализ данных, описанных в рукописи. В экспериментальном лечении эталонный штамм и штамм конкурента один присутствуют в пропорции 0,5 в начале и конце эксперимента в соответствии с контрольной обработкой.
Значения RCI журнала статистически не отличались от нулевых для контрольного лечения или когда эталонный штамм инкубировался штаммом конкурента. Эти данные свидетельствуют о том, что не было никакой конкуренции между эталонной деформацией и штаммом конкурента. В отличие от этого, когда эталонный штамм был инкубирован с штаммом конкурента два, эталонный штамм снизился с доли 0,5 в начале до доли менее 0,01 в конце эксперимента.
Кроме того, значения RCI журнала были значительно больше нуля, когда эталонный штамм был инкубирован с штаммом конкурента два. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что доля эталонного штамма снизилась в присутствии конкурента штамма два предлагая конкуренцию между штаммами. Когда эталонный штамм был инкубирован с конкурентом штамм один, CFUs обоих штаммов увеличилось в течение пяти часов и не были существенно отличаются, предполагая, что никакой конкуренции не произошло.
Кроме того, было отмечено примерно 3200%восстановление, которое статистически не отличалось от контроля. Однако, когда эталонный штамм был инкубирован с штаммом конкурента два, эталонный штамм CFUs были значительно ниже, чем напряжение двух CFUs в контроле на пять часов. Кроме того, примерно 4%восстановление наблюдалось значительно ниже, чем контроль.
В общей сложности эти данные свидетельствуют о том, что штамм два из конкурировали эталонного штамма, убивая его клетки. Наиболее важным шагом в этой процедуре является достижение правильного исходного соотношения, поскольку оно может существенно повлиять на результаты.
