우리의 프로토콜은 비브리오 피셔리 박테리아의 다른 균주 사이의 경쟁 메커니즘을 식별하고 특성화하기 위한 간단하면서도 강력한 접근 방식을 제공합니다. 이 방법은 혼합 배양에서 각 세균긴장의 차등 선택 및 시각 차별을 허용하는 다른 항생 저항 유전자 및 형광 단백질을 인코딩하는 안정적인 플라스미드를 사용합니다. 먼저 멸균 이쑤시개를 사용하여 쌀 알갱이 크기의 한천 접시에서 세포를 긁어냅니다.
LBS 국물의 1 밀리리터를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에서 세포를 다시 중단합니다. 세포 덩어리를 분해하려면 튜브 의 측면으로 누른 다음 적극적으로 위아래로 피펫을 넣습니다. 튜브와 소용돌이를 1~2초 동안 닫고 샘플이 시각적으로 균일할 때까지 세포 덩어리가 계속 보이면 반복합니다.
셀 스크레이핑에서 모든 샘플에 대한 소용돌이에 이르는 이러한 준비 단계를 반복합니다. 모든 시료에 대해 600나노미터의 광학 밀도를 측정하고 기록합니다. 정확한 OD 측정을 얻으려면 LBS 국물을 사용하여 샘플을 최대 10배까지 희석합니다.
그런 다음 각 샘플을 원하는 OD 600으로 정규화합니다. 기준 균주와 경쟁사 균주를 1 대 1 비율로 혼합하려면 1~2초 동안 표시된 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브및 소용돌이에 OD 1.0으로 정규화된 각 변형의 100마이크로리터를 추가합니다. 컨트롤로, 또한 그 자체와 소용돌이의 차별화 태그 버전과 참조 변형을 혼합.
실험결과를 상당히 바꿀 수 있으므로 올바른 시작 비율을 달성하는 것이 중요합니다. 성공을 보장하기 위해,이 단계는 주어진 세균 성 종에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 각 생물학적 복제에 대해 이 단계를 반복한 후, 대조군으로 분화된 기준균과 4개의 생물학적 복제가 분화된 참조 및 경쟁균주로 4개의 생물학적 복제가 있어야 합니다.
배양 후 형광 현미경 검사법에 사용되는 배양 반점을 만들기 위해 각 컨트롤의 10 마이크로리터와 실험 혼합물을 LBS 천을 함유한 페트리 플레이트에 추가합니다. 반점이 완전히 벤치에 건조 한 후, 24 시간 동안 섭씨 24도에서 접시를 배양. 실험이 끝날 때 각 균주에 대한 콜로니 형성 유닛을 정량화하는 데 사용되는 배양 반점을 만들기 위해 각 제어 및 실험 혼합물의 10 마이크로리터를 24개의 웰 플레이트에 추가하여 LBS 한천 1밀리리터를 잘 함유하고 있습니다.
반점이 완전히 말린 후 5 시간 동안 섭씨 24도에서 접시를 배양하십시오. 시작 코인큐베이션 혼합물의 직렬 희석을 수행하려면 96 웰 플레이트 90도 회전하여 8개의 열과 12개의 행이 있습니다. 스트레인 ID, 복제 번호 및 t 0으로 시작하는 시간으로 각 행에 레이블을 지정합니다.
LBS 한천 플레이트에 라벨을 부착하여 희석 계열을 발견하는 동시에 각 항생제 플레이트가 선택하는 균주를 식별합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 180 마이크로리터의 LBS 국물을 각 웰에 추가하여 희석되지 않은 동전 을 혼합하기 위해 첫 번째 열을 비워 둡니다. 200 마이크로리터 단일 채널 파이펫을 사용하여, 첫 번째 컬럼의 첫 번째 우물에 튜브에서 동전 배큐레이션 혼합물의 100 마이크로 리터를 전송한 다음 팁을 버리고 모든 coincubation 혼합물을 반복합니다.
멀티 채널 파이펫을 사용하면 컬럼 1개에서 2열로 20마이크로리터를 전송하고 파이펫을 위아래로 섞어 주세요. 각 희석에 대해 위아래로 파이펫팅 하는 수와 일치 하면서 팁을 삭제 하 고 각 열에 대 한 반복. 끝으로, 각 행은 초기 혼합물의 10 배 직렬 희석을 포함합니다.
8개의 팁이 장착된 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 웰의 마이크로리터5개를 희석 계열로 흡착하고 기준 균주를 선택하는 카나마이신 보충제 LBS agar 플레이트에 스포지트합니다. 이 단계를 반복하여 클로람페니콜 보충 플레이트에 대한 경쟁업체의 스트레인 스포팅을 선택합니다. 반점이 완전히 말린 후, 24섭씨에 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
동전 배큐어 반점과 24 개의 우물 접시가 섭씨 24도에서 5 시간 동안 배양 된 후 LBS 국물 1 밀리리터를 각 우물에 추가하십시오. 모든 셀이 모든 복제에 걸쳐 다시 일시 중단되는 활력과 일치하여 다시 일시 중단 될 때까지 위아래로 파이펫팅하여 다시 중단합니다. 각 코인큐베이션 스팟이 다시 중단되면, 96웰 플레이트를 준비하여 시리얼 희석을 위해 96개의 웰 플레이트를 준비하고 LBS 천판은 이전에 수행한 것과 동일한 방식으로 희석을 발견하는 적절한 항생제를 가지고 있습니다.
24웰 플레이트에서 t 최종 측정을 위한 직렬 희석을 완료하려면 시작 무큐럼의 직렬 희석에 사용되는 단계를 수행하고 이전과 마찬가지로 LBS 천지 플레이트에서 각 희석을 발견합니다. 원고에 설명된 바와 같이 페트리 플레이트및 데이터 분석에서 코인큐베이션 스팟을 이미징하여 진행합니다. 실험적 치료에서, 기준 균주와 경쟁균원은 대조군 처리와 일치하는 실험의 시작과 끝에 0.5의 비율로 존재한다.
로그 RCI 값은 대조군 처리를 위해 또는 기준 균주가 경쟁사 변형 1로 배양되었을 때 0과 통계적으로 다르지 않았습니다. 이러한 데이터는 참조 변형과 경쟁 균주 1 사이의 경쟁이 없었다는 것을 시사한다. 대조적으로, 기준균이 경쟁사 균주 2로 배양되었을 때, 기준 균주는 실험이 끝날 때 0.01 미만의 비율로 초기에 0.5의 비율에서 감소하였다.
또한, 레퍼런스 스트레인이 경쟁사 변형 2로 인큐베이션되었을 때 로그 RCI 값은 0보다 훨씬 컸다. 함께, 이러한 데이터는 경쟁자 변형 의 존재에 기준 균주의 비율이 감소 있음을 나타냅니다 두 균주 사이의 경쟁을 제안. 기준 균주가 경쟁 변형 1로 인큐베이션되었을 때, 두 균주의 CfU는 5 시간 동안 증가했으며 경쟁이 발생하지 않았다는 것을 시사하는 크게 다르지 않았습니다.
또한, 약 3200%의 회복이 관찰되었으며, 이는 대조군과 통계적으로 다르지 않았다. 그러나, 기준 균주가 경쟁사 균주 2로 인큐베이션되었을 때, 기준 균주 CfU는 5시간 만에 대조군에서 균주 2개의 CfU보다 현저히 낮았다. 또한, 약 4%의 회수는 대조군보다 현저히 낮은 것으로 관찰되었다.
전부, 이 데이터는 균주 2 밖으로 그것의 세포를 죽이고서 기준 긴장경쟁했다는 것을 표시합니다. 이 절차에서 가장 중요한 단계는 결과에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 올바른 시작 비율을 달성하는 것입니다.
