Nosso protocolo fornece uma abordagem simples, porém robusta, para identificar e caracterizar mecanismos competitivos entre diferentes cepas de bactérias Vibrio fischeri. Este método utiliza plasmídeos estáveis que codificam diferentes genes de resistência a antibióticos e proteínas fluorescentes que permitem a seleção diferencial e discriminação visual de cada cepa bacteriana em uma cultura mista. Para começar, use um palito estéril para raspar as células do prato de ágar no tamanho de um grão de arroz.
Resuspend as células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de caldo LBS. Para quebrar as moitas celulares, pressione-os para o lado do tubo e, em seguida, pipeta para cima e para baixo vigorosamente. Feche o tubo e o vórtice por um a dois segundos e repita se as aglomerações celulares ainda estiverem visíveis até que a amostra esteja visualmente uniforme.
Repita estas etapas de preparação desde a raspagem celular até o vórtice de todas as amostras. Meça e regise a densidade óptica em 600 nanômetros para todas as amostras. Para obter uma medição de OD precisa, diluir as amostras até 10 vezes usando caldo LBS.
Em seguida, normalize cada amostra para o OD 600 desejado. Para misturar a cepa de referência e a tensão do concorrente em uma proporção de um a um, adicione 100 microliters de cada cepa normalizada a OD 1.0 a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e vórtice por um a dois segundos. Como controle, misture a cepa de referência com uma versão marcada diferencialmente de si mesma e vórtice também.
É fundamental alcançar a razão inicial correta, pois pode alterar consideravelmente o resultado do experimento. Para garantir o sucesso, esta etapa pode exigir otimização para uma determinada espécie bacteriana. Após repetir esta etapa para cada réplica biológica, deve haver quatro réplicas biológicas com cepas de referência marcadas diferencialmente como controles e quatro réplicas biológicas com referências diferenciadas e cepas concorrentes.
Para fazer pontos de cultura que serão usados para microscopia de fluorescência após a incubação, adicione 10 microliters de cada controle e mistura experimental em uma placa de Petri contendo ágar LBS. Depois que as manchas secarem completamente no banco, incubar as placas a 24 graus Celsius por 24 horas. Para fazer pontos culturais que serão usados para quantificar as unidades formadoras da colônia para cada cepa no final do experimento, adicione 10 microliters de cada controle e misturas experimentais em 24 placas de poço contendo um mililitro de ágar LBS por poço.
Depois que as manchas secarem completamente, incubar as placas a 24 graus Celsius por cinco horas. Para realizar uma diluição serial de misturas de coincubação inicial, gire uma placa de 96 poços 90 graus para que haja oito colunas e 12 linhas. Rotule cada linha com o ID de tensão, o número de réplica e o tempo começando com t zero.
Rotule as placas de ágar LBS suplementadas com o antibiótico apropriado para detectar a série de diluição, certificando-se de identificar para qual cepa cada placa de antibiótico está selecionando. Com uma pipeta multicanal, adicione 180 microliters de caldo LBS a cada poço deixando a primeira coluna vazia para a mistura de cunhagem não diluída. Usando uma pipeta de canal único de 200 microliteres, transfira 100 microliters da mistura de cunhagem do tubo para o primeiro poço da primeira coluna, depois descarte a ponta e repita para todas as misturas de coincubação.
Com uma pipeta multicanal, transfira 20 microliters da coluna um para a coluna dois e pipeta para cima e para baixo para misturar. Descarte as pontas e repita para cada coluna, sendo consistente com o número de pipetting para cima e para baixo para cada diluição. Ao final, cada linha conterá uma diluição serial de 10 vezes da mistura inicial.
Use uma pipeta multicanal equipada com oito dicas para aspirar cinco microliters de cada poço em uma série de diluição e detectar na placa de ágar lbs complementada kanamicina que seleciona para a cepa de referência. Repita esta etapa para selecionar para a cepa do competidor que está na placa complementada de Clororamfenicol. Depois que as manchas secarem completamente, coloque as placas na incubadora a 24 graus Celsius.
Após as manchas de cunhagem e as 24 placas de poço foram incubadas por cinco horas a 24 graus Celsius, adicione um mililitro de caldo LBS a cada poço. Resuspend por pipetação para cima e para baixo até que todas as células tenham sido resuspended sendo consistente com o vigor em que as células são resuspended em todas as réplicas. Uma vez que cada ponto de coincubação é resuspended, prepare uma placa de 96 poços para uma diluição serial e placas de ágar LBS com os antibióticos apropriados para detectar a diluição da mesma forma que feito anteriormente.
Para completar a diluição serial para as medidas finais t nas 24 placas do poço, realize etapas utilizadas para a diluição serial do inóculo inicial e localiza cada diluição em placas de ágar LBS como feito anteriormente. Proceda com a imagem dos pontos de cunhagem nas placas de Petri e análise de dados, conforme descrito no manuscrito. No tratamento experimental, a cepa de referência e a tensão concorrente estão presentes em uma proporção de 0,5 no início e no final do experimento consistentes com o tratamento de controle.
Os valores de Log RCI não foram estatisticamente diferentes de zero para o tratamento de controle ou quando a cepa de referência foi incubada com a tensão do concorrente. Esses dados sugerem que não houve competição entre a cepa de referência e a tensão do concorrente. Em contrapartida, quando a cepa de referência foi incubada com a cepa de concorrente dois, a cepa de referência diminuiu de uma proporção de 0,5 no início para uma proporção inferior a 0,01 no final do experimento.
Além disso, os valores de RCI log foram significativamente maiores que zero quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente dois. Juntos, esses dados indicam que a proporção da cepa de referência diminuiu na presença de tensão concorrente dois sugerindo competição entre as cepas. Quando a cepa de referência foi incubada com a tensão do competidor, as CFUs de ambas as cepas aumentaram ao longo de cinco horas e não foram significativamente diferentes sugerindo que não ocorreu competição.
Além disso, observou-se aproximadamente 3200% de recuperação, o que não foi estatisticamente diferente do controle. No entanto, quando a cepa de referência foi incubada com a tensão do concorrente dois, as CFUs de cepa de referência foram significativamente inferiores à tensão de duas UFC no controle em cinco horas. Além disso, observou-se recuperação de aproximadamente 4%, significativamente menor do que o controle.
Ao todo, esses dados indicam que a tensão de dois fora competiu a cepa de referência matando suas células. O passo mais importante neste procedimento é alcançar a razão inicial correta, pois pode impactar significativamente os resultados.
