Este trabajo fue apoyado por el Labex MemoLife y por el ARSEP (Fondation pour l&#39;aide à la recherche sur la sclérose en plaques)

1. Soluciones y Materiales <ol><li> Preparar soluciones de los vasos de aislamiento: B1, añadir 1,5 ml de HEPES 1 M a 150 ml de HBSS; B2, añadir 3,6 g de dextrano a 20 ml de B1; B3, añadir 1 g de BSA a 100 ml de B1. </li><li> Modificar el soporte del filtro mediante la reducción de la parte inferior de la parte superior de atornillado. </li><li> Preparar soluciones de inmunotinción: solución de fijación, 4% de paraformaldehído en PBS pH 7,4; Permeabilización / solución de bloqueo, diluir suero de cabra al 5% y Triton X100 al 0,25% en PBS pH 7,4. Nota: La fijación depende del tipo de anticuerpos primarios utilizados. </li></ol> 2. Disección Nota: No se requieren condiciones estériles, a menos que los buques se utilizan para fines de cultivo celular. <ol><li> Preparar un vaso de precipitados de 150 ml con 20 ml de B1. Mantenga en hielo y cubrir con parafilm para evitar la contaminación del aire. </li><li> Profundamente anestesiar el ratón bajo una campana con una pequeña toalla de papel empapado en 1 ml de isoflurano pura que se añade into la jaula. La anestesia se verifica por la falta de reacción a una pizca dedo del pie. Matar el ratón por dislocación cervical. NOTA: Estos pasos se llevan a cabo de conformidad con las normas nacionales e institucionales. </li><li> Opcional: Realice la perfusión intracardíaca con 20 ml de PBS 1x para eliminar el contenido de sangre 24. </li><li> Sección de la piel con un bisturí desde el cuello hasta la nariz y tirar a la basura. Retire todos los pelos que contaminan con PBS 1x. </li><li> Para abrir el cráneo, primero insertar tijeras anteriormente hasta el bulbo olfatorio, y abrir las tijeras para romper el cráneo en dos partes. </li><li> Retire con cuidado el cerebro usando una espátula de cerebro. Diseccionar el plexo coroideo de los ventrículos laterales, ya que contaminarían la preparación de los vasos sanguíneos 38. NOTA: Opcional: La preparación final contendrá los vasos del parénquima y meninges. Si no se desea, meninges puede despegarse siguiendo el procedimiento descrito por 38. </li><li> Transfer el cerebro en el vaso de precipitados que contiene la solución B1 en hielo. Hasta 8 cerebros pueden tratarse juntos. </li></ol> 3. Cerebro Tejido Homogeneización <ol><li> El uso de dos escalpelos, manualmente y vigorosamente vencieron el cerebro en la solución B1 posteriormente la obtención de pequeñas piezas de aproximadamente 2 mm. </li><li> Homogeneizar la preparación con un homogeneizador Dounce automatizado, realizando 20 golpes a 400 rpm. Asegúrese de que el tubo de vidrio se mantiene en hielo y que la parte superior de la douncer está en solución cuando se mueve arriba y abajo, a fin de evitar la formación de bolsas de aire. Si se preparan varias muestras, se lava la douncer con agua desionizada entre cada homogeneización. </li></ol> Purificación 4. Recipiente <ol><li> Transferir el homogeneizado en un tubo de plástico de 50 ml y proceder a la centrifugación a 2.000 g durante 10 min a 4 ° C. Una gran interfaz blanco (en su mayoría de mielina) se forma en la parte superior de la pastilla recipiente (rojo si no se realizó la perfusión). </li><li> Eliminar el sobrenadante. El sedimento de buque y la interfaz blanco permanecerá unida juntos. Añadir 20 ml de solución B2 enfriado con hielo y agitar el tubo de forma manual y vigorosamente durante 1 min. </li><li> Proceder a la segunda centrifugación a 4400 g durante 15 min a 4 ° C. La mielina ahora formará una capa blanca densa en la superficie del sobrenadante. </li><li> Separar con cuidado la capa de mielina de las paredes del tubo manteniendo el tubo y lentamente girar para permitir que el sobrenadante a pasar a lo largo de las paredes. Desechar la mielina con el sobrenadante. El sedimento que contiene los vasos permanece unido en la parte inferior del tubo. </li><li> Seque la pared interior del tubo con un papel absorbente envuelto alrededor de una pipeta de plástico 5 ml y eliminar todos los fluidos residuales, evite tocar el pellet buque. Mantenga el tubo boca abajo sobre un papel absorbente para drenar cualquier líquido restante. </li><li> Suspender el sedimento en 1 ml de solución B3 helada pipeteando arriba y abajo con las puntas de baja unión, keeping el tubo en hielo, a continuación, añadir otros 5 ml de solución B3. Asegúrese de que los buques se dispersan tanto como sea posible y no forman agregados. </li></ol> 5. Filtración <ol><li> Preparar un vaso de precipitados sobre hielo con 30 ml de solución de B3 enfriado con hielo. Cubra con parafilm para evitar la contaminación del aire. </li><li> Colocar un filtro de 20 micras de malla en un soporte de filtro modificado en la parte superior de un matraz de Becker y equilibrar mediante la aplicación de 10 ml de solución B3 enfriado con hielo. </li><li> Verter la preparación recipiente en el filtro y enjuagar los vasos con 40 ml de solución de B3 enfriado con hielo. </li><li> Recuperar el filtro utilizando pinzas limpias e inmediatamente sumerja en el vaso que contiene la solución B3. Separe los buques del filtro sacudiéndolo suavemente. </li><li> Verter el contenido vaso de precipitados en un tubo de plástico 50 ml y centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Nota: Como alternativa, la suspensión de los vasos cerebrales &#39;desde el paso 4.6 se puede filtrar sobre un filtro de 100 micras de malla.En este caso, los buques más grandes se retienen preferentemente en el filtro, mientras que el flujo a través de los microvasos (principalmente contiene capilares), que luego se filtró en un filtro de 20 micras de malla como anteriormente. </li><li> Resuspender el sedimento de microvasos en 1 ml de solución B3 enfriado con hielo y transferirlo pipeteando en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C. </li></ol> 6. La fijación, permeabilización y el bloqueo <ol><li> Vasos de transferencia transfiriendo al vaso 0,2 ml tubos de PCR que contienen PBS utilizando una punta de unión de baja de 1,0 ml. Tener cuidado de no tocar los vasos, ya que pueden adherirse a la parte exterior de la punta. Realice todos los siguientes pasos bajo un microscopio binocular. </li><li> Para cada uno de los siguientes cambios de medio, deje los tubos en hielo hasta que los barcos han llegado a la parte inferior, y la pipeta a cabo la mayor parte de los líquidos utilizando largas y cosa puntas de pipeta de gel de carga. </li><li> Retire la mayor parte del PBS y añadir 200 l de solución de fijación.Suspender los vasos agitando suavemente y se incuba durante 20 min a TA. </li><li> Pipetear la solución de fijación y reemplazarlo con 200 l de PBS 1x (primer lavado), se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente y repita este paso 3 veces. Cada vez, compruebe que los barcos se han hundido correctamente a la parte inferior de los tubos y la pipeta fuera 1x PBS, asegurando los buques no se tocan. </li><li> Después del último lavado, reemplace 1x PBS por la solución de permeabilización / bloqueo y se incuba 1 hora a RT, la resuspensión de los vasos agitando suavemente de vez en cuando. </li></ol> 7. La inmunotinción <ol><li> Vuelva a colocar la solución de permeabilización / bloqueo con la mezcla de anticuerpos primarios (véanse las referencias de los anticuerpos utilizados aquí y diluciones en la tabla de plantilla de Materiales) diluido en la solución de permeabilización / bloqueo, y se incuba a 4 ° CO / N. </li><li> Después de 3 lavados en PBS a temperatura ambiente, se incuban los vasos con la mezcla de anticuerpos secundarios diluido en PBS durante 2 horasa TA. </li><li> Nota: le recomendamos realizar la tinción nuclear con Hoechst (1: 2000) o DAPI (1: 2000) con el fin de distinguir los vasos de posibles contaminantes pelos o polvo en el microscopio. </li><li> Después de 3 lavados en PBS, resuspender los vasos en 50 l de PBS. </li></ol> 8. Montaje y Observación <ol><li> Preparar una punta con un capilar de vidrio siliconado: cortar una punta de pipeta P200 utilizando un bisturí y ajustar el capilar interior. El volumen aproximado del capilar es de 40 l. </li><li> La transferencia de los buques a un portaobjetos de vidrio utilizando el capilar de vidrio siliconado y retirar con cuidado el líquido con un trozo de papel absorbente. </li><li> Aplique una gota de medio de montaje en los vasos y mantenga un cubreobjetos a 45º permitiendo la caída se extienda a lo largo del borde de la hoja. Deje que se apaga el cubreobjetos y deje a medio y se extendió lentamente. Deje que se seca O / N a temperatura ambiente con la protección de la luz. Los buques se pueden observar bajo un colgmicroscopio confocal ent. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La barrera sangre-cerebro regula el paso de sustancias fisiológicas dentro y fuera del SNC y lo protege contra sustancias potencialmente nocivas presentes en la sangre. Está implicado en varias patologías del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neurodegenerativas 2 y 28 tumores cerebrales. La muy baja permeabilidad de la BHE también dificulta el paso de agentes terapéuticos dirigidos células neuronales y el desarrollo de métodos que tengan la intención de abrir de forma reversible la BHE...

El funcionamiento adecuado del sistema nervioso central (SNC) requiere un entorno extracelular altamente regulado, y sus demandas metabólicas son enormes en comparación con otros órganos 1. El SNC es también extremadamente sensibles a una amplia gama de productos químicos, generalmente inofensivo para los órganos periféricos, pero a la misma, neurotóxico. Para garantizar el correcto funcionamiento, la mayor parte del &#39;vasculatura SNC forma una barrera endotelial; la barrera hematoencefálica (BBB), que controla el flujo de moléculas e iones, así como el paso de las células inmunes entre la sangre y el cerebro, lo que se mantiene la homeostasis adecuada 2, sino también limitar la entrada de drogas terapéuticas, los tratamientos que impiden por lo tanto de trastornos neurológicos 3. A nivel celular, la BBB se sostiene principalmente por extensas uniones estrechas entre las células endoteliales, la expresión de los transportadores de eflujo polarizado y una tasa muy baja transcitosis 4. Propiedades y funciones de la BBB se inducen principalmente por necélulas ighboring 4. En particular, los pericitos juegan un papel importante en la inducción y mantenimiento de la BBB 5,6. Siendo células contráctiles, pericitos también regulan el flujo sanguíneo 7 al igual que las células del músculo liso que rodean los grandes vasos. Por último, los astrocitos, las principales células gliales del cerebro, enviar grandes procesos denominados endfeet alrededor de la mayor parte de la vasculatura del cerebro 8 y modular la acreditación integridad y la quiescencia inmune 9, la transferencia de metabolitos a las neuronas 10, e inducir el estrecho acoplamiento entre la actividad neuronal y el flujo de sangre 11,12. La capacidad para estudiar las propiedades moleculares y celulares del sistema cerebrovascular es crucial para caracterizar mejor su contribución a la fisiología del cerebro y la fisiopatología. Para abordar esta cuestión, las estrategias para aislar el sistema vascular cerebral del cerebro se han desarrollado, que permite la preparación de fragmentos de vasos cerebrales intactas. Cerebral buque purification fue descrito inicialmente utilizando cerebros bovinos 13 y mejorado y adaptado a otras especies, en particular los roedores 14. En este último estudio, se introdujo el uso de filtros de diferentes tamaños para separar los vasos cerebrales en al fracciones enriquecidas en los vasos de diferentes diámetros. Curiosamente, en estas preparaciones, las células endoteliales mantienen sus propiedades metabólicas 15, funcionalidad transportador 16 y 17 de polarización. A continuación, describimos en detalle este protocolo y demostrar, además, que los vasos aislados conservan la mayor parte de sus estructuras en situ. Las células endoteliales se mantienen unidos por uniones estrechas y rodeado por una lámina basal continua. Pericitos y células musculares lisas de permanecer unidos a la capa endotelial, así como de astrocitos perivasculares membranas. Sin embargo, se eliminan astrocitos, células microgliales, neuronas y oligodendrocitos. Por último, se describe un procedimiento para llevar a cabo la inmunotinción en vasos cerebrales aisladas. </p&gt; Hasta ahora la mayoría de los estudios moleculares y celulares en relación con el sistema cerebrovascular se han realizado en células de los vasos cerebrales purificados disociados por la célula de clasificación utilizando cepas reportero ratón específicos de células o procedimientos basados ​​en inmunotinción 18,19. Aunque estas técnicas permite el aislamiento de las poblaciones de células cerebrovasculares casi puros, células aisladas pierden por completo su in situ morfología y las interacciones, que a su vez, afecta en gran medida sus propiedades moleculares y celulares. El protocolo descrito aquí, lo que permite el aislamiento de fragmentos cerebrovasculares enteros sin necesidad de anticuerpos específicos o manchas de ratones transgénicos, ofrece una buena alternativa como la estructura general de los vasos cerebrales aisladas se conserva, por lo tanto, disminuyendo repercusiones sobre sus propiedades moleculares. Vasos aislados podrían entonces ser utilizados para el estudio de la actividad genética, la síntesis de proteínas y la regulación de la acreditación como se ha descrito recientemente 20,21 </sup&gt;. Por último, en comparación con láser captura microdissection 22,23 del presente protocolo es barato, fácil de realizar y rápidamente adaptables a cualquier laboratorio.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Grinder Size C</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>3431E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5415&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance, Modular Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact System Provides High Quality Leica LED1000</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low binding tips (P1000)</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>14200T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 20&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 100&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1014356290F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P10143263NR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;PARAFILM&#174; M (roll size 4 in. &#215; 125 ft)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Life technology</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>ET330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&#174; 488 Conjugate; Dilution 1/100</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (rabbit) ; dilution 1/400</td>
			<td colspan="2">kindly provided by Dr Markus A Ruegg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>33-9100</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti GFAP (mouse, clone GA5)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3893</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti AQP4 (rabbit)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Cx43 (mouse, Clone&#160; 2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610061</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Olig2 (rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&#160;dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NF-M (mouse)</td>
			<td colspan="2">provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.</td>
			<td>&#160;dilution 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>&#160;dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11034</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21424</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21429</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of mouse brain vessels

En el cerebro, la mayor parte del sistema vascular consiste en una barrera selectiva, la barrera hematoencefálica (BBB) ​​que regula el intercambio de moléculas y células inmunes entre el cerebro y la sangre. Por otra parte, la enorme demanda metabólica neuronal requiere una regulación de momento a momento del flujo sanguíneo. Cabe destacar que las anomalías de estas regulaciones son características etiológicas de la mayoría de las patologías cerebrales; incluyendo glioblastoma, accidente cerebrovascular, edema, epilepsia, enfermedades degenerativas (por ejemplo: enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer), tumores cerebrales, así como las condiciones inflamatorias tales como esclerosis múltiple, meningitis y disfunciones cerebrales sepsis inducida. Por lo tanto, la comprensión de los eventos de señalización que modulan la fisiología vascular cerebral es un gran desafío. Mucho penetración en las propiedades celulares y moleculares de los diversos tipos de células que componen el sistema cerebrovascular se puede obtener de cultivo primario o clasificación de células a partir de tejido cerebral recién disociada. Sin embargo,propiedades tales como la polaridad celular, la morfología y relaciones intercelulares no se mantienen en tales preparaciones. El protocolo que se describe aquí está diseñado para purificar fragmentos de vasos del cerebro, mientras que el mantenimiento de la integridad estructural. Se demuestra que los vasos aislados consisten en células endoteliales sellados por uniones estrechas que están rodeados por una lámina basal continua. Los pericitos, células de músculo liso, así como las membranas de astrocitos perivasculares endfeet permanecen unidos a la capa endotelial. Por último, se describe cómo llevar a cabo experimentos de inmunotinción en vasos cerebrales purificados.

Aquí se describe un protocolo que permite el aislamiento mecánico de los vasos cerebrales 14. Figura 1 resume las principales etapas de esta técnica. La arquitectura de los vasos cerebrales es compleja e incluye varios tipos de células, es decir, células endoteliales sellados por uniones estrechas y rodeados por pericitos, células musculares lisas, y procesos de pie 9 de astrocitos. Por lo tanto, después del aislamiento de los vasos cerebrales, que tuvo como objetiv...

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Purification of Mouse Brain Vessels

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

La purificación de los buques de cerebro de ratón

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K vistas.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes. 

Video: Purification of Mouse Brain Vessels

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Investigación

Neurociencias

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiples imágenes del ratón neuroanatómicos de Resonancia Magnética

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Todo el montaje de imágenes de embriones de ratón Proyecciones sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

Purificación de la fracción defípoda dendrítica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, and a ventricular zone niche, which generates the inhibitory GABAergic Purkinje cells, which are neurons that constitute the deep cerebellar nuclei and Bergman glia. Recently, a third stem cell niche has been described that arises as a secondary germinal zone from the ventricular zone niche. The cells of this niche are defined by the cell surface marker prominin-1 and are localized to the developing white matter of the postnatal cerebellum. This niche accounts for the late born molecular layer GABAergic interneurons along with postnatally generated cerebellar astrocytes. In addition to their developmental role, this niche is gaining translational importance in regards to its involvement in neurodegeneration and tumorigenesis. The biology of these cells has been difficult to decipher because of a lack of efficient techniques for their purification. Demonstrated here are efficient methods to purify, culture, and differentiate these postnatal cerebellar stem cells.

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Demonstrated here is an efficient and cost-effective method to purify, culture, and differentiate white matter stem cells from postnatal mouse cerebellum.

Purificación de Prominin-1+ Células Madre del Cerebelo de Ratón Postnatal

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol describes in vivo labeling and subsequent purification of newly synthesized proteins using an engineered mouse line to direct protein labeling to specific cellular populations. It is an inducible line by Cre recombinase expression of L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*), enabling azidonorleucine (ANL) incorporation to the proteins, which otherwise will not occur. Using the method described here, it is possible to purify cell-type-specific proteomes labeled in vivo and detect subtle changes in protein content due to sample complexity reduction.

This protocol describes how to perform cell-type-specific protein labeling with azidonorleucine (ANL) using a mouse line expressing a mutant L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*) and the necessary steps for labeled cell-type-specific proteins isolation. We outline two possible ANL administration routes in live mice by (1) drinking water and (2) intraperitoneal injections.

Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante