RVS con el apoyo de nuevo investigador de puesta en marcha de fondos de Albert Einstein College of Medicine de la Universidad Yeshiva.

1. Los animales fueron perfundidos y disección Cerebelo <ol><li> Dependiendo de la proteína, la perfusión puede ser esencial para el 1,2 tinción con éxito. La perfusión transcardiaca es una técnica invasiva, no la supervivencia de procedimiento que requiere el uso apropiado de anestésicos. Formación adecuada, la aprobación institucional, y la aprobación del IACUC son necesarios antes de intentar el procedimiento. Siempre es una buena idea consultar a los veterinarios de la institución para obtener ayuda en la identificación de las necesidades experimentales y la adquisición de la formación correcta. Antes del procedimiento, el animal debe ser profundamente anestesiados y no responde a los estímulos, como la fiebre o la pizca de cola. Utilizando unas tijeras hacer un corte en la piel del abdomen y la pared muscular y luego continuar para abrir la caja torácica cortando justo al lado del esternón, a cada lado. Además, el experimentador puede crear un mayor espacio de trabajo interno por el corte de la fascia que rodea el diafragma. Al levantar la pared abdominal y torácica superioRLY, el corazón ahora serán expuestos. Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha para que la sangre fluya hacia el exterior e inmediatamente inserte la aguja de perfusión en el ventrículo izquierdo. Una bomba hidrostática de base es preferible ofrecer las soluciones de perfusión (ver Tabla 1 para más detalles). En primer lugar, limpiar la sangre con fosfato 0,1 M (PBS, ver Tabla 3) hasta que el líquido salga transparente. A continuación, apague la bomba hidrostática, cambiar rápidamente el tubo de entrega de la solución a un recipiente de 4% de paraformaldehído (PFA, ver Tabla 3) diluido en PBS y luego girar a la bomba de nuevo para ofrecer el fijador. El uso de una bomba no es necesario: con la práctica, dos jeringas llenas de PBS y 4% PFA se puede utilizar para entregar lentamente las soluciones. </li><li> Es crítico para disecar cuidadosamente el cerebro fuera del cráneo sin introducir ninguna lesión al tejido. Aun pequeñas laceraciones en el cerebro durante la disección se ampliará gradualmente en las grietas visibles queanticuerpos de captura y causar manchas artefactual durante el procesamiento de los tejidos (por ejemplo, asteriscos rojos en la figura 2). Para las disecciones del cerebelo, que es típico para cortar la piel por la mitad de la cabeza y luego suavemente se burlan de las aletas, aparte de exponer el cráneo. Cortar la cabeza de adelante hacia atrás a lo largo de la línea media dorsal, y también lateralmente a ambos lados del cráneo. No corte más allá de la bregma, ya que corre el riesgo de mellar el cerebelo. El uso de pinzas levante suavemente la parte frontal del cráneo fuera del cerebro con cuidado de no rasgar el tejido cerebral que se adjunta a las meninges. Sever los nervios craneales en el lado ventral del cerebro. </li><li> La separación del cerebelo del resto del cerebro es importante por dos razones. En primer lugar, permite la exploración de los patrones de expresión en los lóbulos anteriores, que están ocultos a la vista por el colículo in situ. La segunda es que la separación del tejido en pequeñas, las regiones aisladas permite mmineral completa fijación, que puede facilitar la tinción de algunas proteínas. A lo largo de esta etapa final de la disección, se debe tener cuidado de no tocar el cerebelo con las puntas de la pinza. Inserte las puntas de un par de pinzas en el medio de los tubérculos cuadrigéminos superiores e inferiores. Con un segundo juego de pinzas poco a poco se burlan de distancia del colículo inferior del cerebelo. Luego, coloque el cerebelo de modo que su cara anterior está orientada hacia abajo y el tronco cerebral está apuntando hacia arriba. Inserte las pinzas en el cuarto ventrículo entre el tronco cerebral y lóbulos IX / X del cerebelo. Cortar los pedúnculos pellizcando con las pinzas a ambos lados y luego levante suavemente el cerebelo lejos del tronco cerebral. Una vez que el cerebelo se aísla, se post-fijar por inmersión en 4% PFA a 4 ° C durante un mínimo de 24-48 horas. El cerebelo se puede almacenar en un 4% PFA durante un período prolongado de tiempo. Las meninges debe ser eliminado, ya sea antes o después de la tinción para una mejor visibilidad de los patrones de expresión.Si el experimentador elige para eliminar las meninges antes de la tinción existe una gran posibilidad de que el cerebelo se mellado durante el proceso. Pelar las meninges al final del procedimiento de tinción es mucho más sencillo porque se vuelven más fácil de localizar después de que adquieren tinción de fondo débil y convertirse en frágil post-procesamiento. </li></ol> 2. El procesamiento del tejido para la tinción wholemount Debido a que el enfoque de tinción wholemount lleva más tiempo que la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido, es muy útil para planificar la línea de tiempo para cada uno de los experimentos, como se muestra en el calendario ejemplo proporcionado (Tabla 2). Antes de comenzar, hay varias cosas importantes a tener en cuenta. 1) Los microtubos que contienen el tejido debe girar sobre un nutator en todo momento, excepto durante el proceso de congelación / descongelación. 2) Varias soluciones se debe hacer de nuevo para cada experimento (Ver Tabla 3 para las recetas de solución). 3)A lo largo del protocolo, al cambiar las soluciones, con cuidado vierta la solución pasaba en lugar de eliminar el cerebelo con una pinza, para evitar tocar el cerebelo. Luego, después de mezclar la nueva solución en otro recipiente, utilizar una pipeta para añadir suavemente la solución fresca al tubo. 2,1 Día 1: <ol class="lalpha"><li> Fijar el cerebelo en tres corrección de Dent a temperatura ambiente durante 6-8 horas meciéndose suavemente en el nutator. Si el metanol es destructivo para el antígeno, considerar la sustitución de los pasos a través 2.1ay 2.3a con un método de recuperación de antígenos. El calor y los buffers usados ​​para la recuperación de antígenos ayudará a preparar el tejido para la penetración de anticuerpos. </li><li> Bleach del cerebelo en Bleach Dent 3 la noche a 4 ° C. </li></ol> 2,2 Día 2: <ol class="lalpha"><li> Deshidratar el cerebelo en dos rondas de 100% MeOH a temperatura ambiente durante 30 minutos cada una. </li><li> A continuación, para mejorar la penetración de las soluciones, sujetoel tejido a una serie de ciclos de congelación / descongelación. Coloque cuidadosamente el tubo en un recipiente con hielo seco y congelación durante 30 min. A continuación, retire el tubo y dejarlo a temperatura ambiente en el banco durante 15 minutos. El paso de congelación / descongelación debe llevarse a cabo cuatro veces (al menos). </li><li> Después de la última descongelación del tejido, coloque el tubo en un congelador -80 ° C durante la noche. </li><li> El tejido se puede almacenar durante períodos prolongados de tiempo a -80 ° C inmediatamente antes o después de las etapas de congelación / descongelación. De lo contrario, el protocolo debe continuar. </li></ol> 2.3 Día 3: <ol class="lalpha"><li> Rehidratar el cerebelo por lavado en 50% MeOH/50% de PBS, el 15% MeOH/85% PBS, y 100% de PBS durante 60-90 minutos cada una a temperatura ambiente. </li><li> A continuación, para adulto cerebelo del ratón, el tejido sujeto a la digestión enzimática con 10μg/ml de proteinasa K en PBS durante 2-3 minutos. Ningún paso es necesario para la digestión cerebelo de animales jóvenes (P5 o menos en el ratón). Ya digestion se sugiere para los cerebros más grandes. Por ejemplo, la digestión podría ser tan alta como 5-6 minutos para cerebros de primates 4. </li><li> Después de la digestión, lávese el cerebelo en PBS tres veces durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente para eliminar la Proteinasa K. </li><li> Bloquee el tejido en el PMT (ver Tabla 3) la noche a 4 ° C. La leche en polvo es a menudo la primera elección cuando se selecciona un agente de bloqueo para el trabajo proteína porque es barato, reduce eficazmente la tinción de fondo, y típicamente no interfiere con la unión de los anticuerpos o el acceso al antígeno. Sueros animales también se puede utilizar, aunque el experimentador debe ser consciente del coste añadido y primero debe comprobar la calidad del suero para reacción cruzada inmunoglobulinas y la capacidad para producir una señal a ruido óptima. </li></ol> 2.4 Día 4-5: <ol class="lalpha"><li> Incubar el tejido en anticuerpos primarios diluidos en PMT suplementado con 5% de DMSO durante 48 horas a 4 ° C (Larger cerebelo se requieren mayores tiempos de incubación). </li></ol> 2.5 Día 6: <ol class="lalpha"><li> Lavar el cerebelo 2-3 veces durante 2-3 horas cada una en la PMT a 4 ° C para eliminar los anticuerpos no unidos primarios. </li><li> A continuación, se incuba el tejido en secundaria de anticuerpos en una solución que contiene PMT con 5% de DMSO a 4 ° C durante la noche (más grande cerebelo pueden requerir mayores tiempos de incubación). </li></ol> 2.6 Día 7: <ol class="lalpha"><li> Lave el cerebelo 2-3 veces durante 2-3 horas cada una en el PMT a 4 ° C. </li><li> Dar el tejido de un lavado final con PBT (ver Tabla 3) durante 1-2 horas. Este paso elimina el exceso de leche y aumenta la claridad de la tinción. </li><li> Finalmente, se incuba el tejido en DAB (3,3 &#39;-diaminobencidina) solución hasta que la intensidad de la tinción óptima se alcanza. El producto de reacción marrón debe ser claramente visible dentro de ~ 10 minutos. Lo mejor es utilizar el DAB en la oscuridad como la luz hace que el cromógeno de precipitaciónte, que puede aumentar la tinción de fondo. </li></ol> 2.7 Cuando la intensidad de la tinción óptima se alcanza, detener la reacción mediante la colocación del cerebelo en PBS con azida de sodio 0,04%. El tejido puede ser almacenado a largo plazo en esta solución. Azida de sodio es un potente inhibidor del crecimiento bacteriano, pero debe evitarse hasta este paso, ya que también inhibe la peroxidasa de rábano picante. 2.8 procedimiento de amplificación Opcional: seguir el protocolo normal, pero estos pasos deben realizarse en el lugar de los pasos 2.5b-2.7. <ol class="lalpha"><li> Incubar el tejido durante la noche a 4 ° C en biotina-conjugado con anticuerpos secundarios en PBST (ver Tabla 3) con 5% de DMSO. </li><li> Lavar el tejido durante 2-3 horas cada una en los cambios de PBST 3-4 a temperatura ambiente. </li><li> Incubar el cerebelo durante la noche a 4 ° C en la solución del complejo ABC en PBST. </li><li> Enjuague el tejido durante 2-3 horas cada uno ena temperatura ambiente en los cambios de PBS 3-4. </li><li> Incubar el tejido en solución DAB recién preparado, como se describió anteriormente. </li><li> Cuando la tinción es óptimo, detener la reacción por lavado el cerebelo en PBS con azida de sodio 0,04%. </li></ol> 3. Imagen del tejido teñido <ol><li> Wholemount imágenes se pueden capturar mediante el uso de, por ejemplo, una cámara de Leica DFC3000 FX montada en un microscopio estereoscópico Leica MZ16 FA corriendo Leica Application Suite de software de FX. Si se desea, la microscopía deconvolución se puede utilizar para adquirir múltiples imágenes consecutivas en diferentes planos focales, con cada imagen que tiene sólo un único lóbulo de enfoque nítido. Entonces, las imágenes se puede comprimir en una sola pila y software prestado para eliminar la distorsión. La imagen compuesta final se ilustran los patrones de expresión de la superficie del cerebelo, con todos los patrones visibles en un enfoque claro. </li><li> Tejido teñido wholemount debe ser reflejada mientras se está inmerso en PBS (u otro medio que dé unaíndice de refracción óptimo). Con el fin de posicionar fácilmente la wholemount para formación de imágenes, hacer un gel de agar al 1% en una placa Petri de plástico. Cortar pequeños agujeros en el gel. Los agujeros permitirá que el cerebelo para ser encajada en la orientación deseada. </li><li> Los datos brutos se importan a Adobe Photoshop CS4 y ajustado por los niveles de contraste y brillo. </li></ol> Animales Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en virtud de un protocolo de animales aprobado IACUC de acuerdo con las directrices institucionales en el Albert Einstein College of Medicine. Macho y hembra outbred Swiss Webster (Taconic, Albany, NY) ratones se mantuvieron en nuestra colonia y se utiliza para todos los estudios. Ratas adultas sacrificados fueron amablemente proporcionados por el doctor Bryen Jordania (Albert Einstein College of Medicine). Todos los animales fueron al menos un mes. 4. Los resultados representativos El cerebelo está compartimentado por la expresión molecular en cuatro zonas transversales:la zona anterior (AZ: ~ lóbulos IV), la zona central (CZ: ~ lóbulos VI-VII), la zona posterior (PZ: ~ lóbulos VIII-IX dorsal) y la zona nodular (NZ: ~ lóbulos ventral y IX X ) 5. Cada zona contiene una gama única de parasagital rayas 1,2,5,6 (Fig. 1). ZebrinII expresión en células de Purkinje revela rayas en la AZ y PZ (Fig. 2) y expresión uniforme en la CZ y NZ (fig. 2). La organización parasagital de células de Purkinje se refleja en el campo de la topografía de terminales de las fibras aferentes. La cocaína y la anfetamina regulado transcripción (CART) péptido se expresa en los subgrupos de fibras trepadoras (Fig. 3) que el proyecto a las rayas de las dendritas de células de Purkinje en la capa molecular del cerebelo de la corteza cerebral 7 (Figura 3b). Con las modificaciones apropiadas, tales como la amplificación del 7, el protocolo wholemount permite la visualización de patrones olivocerebellar sin need para una reconstrucción de laboriosos, de teñir secciones de tejido (Figura 3b). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig1.jpg" /> Figura 1. A. ZebrinII / aldolaseC expresión revela bandas sagitales en las secciones transversales del cerebelo. Barra de escala = 500 m. B. ZebrinII / aldolaseC se expresa exclusivamente en somata de células de Purkinje y las dendritas. Barra de escala = 150μm (gl = capa granular; pcl = capa de células de Purkinje; ml = capa molecular). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig2.jpg" /> Figura 2. Un cerebelo wholemount teñidos para ZebrinII / aldolaseC mostrando rayas células de Purkinje en las imágenes de la parte anterior (AZ), central (República Checa), y posterior (PZ) Zonas del cerebelo. Este trabajo también muestra un ejemplo de la consecuencia negativa de mellar el cerebelo. La tinción resultante artefactual se indicacon un asterisco rojo. Barra de escala = 1 mm (LS = simple lobulus; PML = paramediana lóbulo; CP = cópula pyramidis). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig3.jpg" /> Figura 3. Carro A. se expresa en la escalada terminales de fibra en la capa molecular. Barra de escala = 100 m. (Ml = capa molecular; pcl = capa de células de Purkinje; gl = capa granular) B. wholemount inmunohistoquímica de la expresión de CART en la NZ. Barra de escala = 2 mm (COP = cópula pyramidis; PML = paramediana lóbulo; PFL = paraflocculus, FL = flóculo).

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No tenemos nada que revelar.

Hemos descrito los detalles técnicos necesarios para la tinción wholemount éxito utilizando un enfoque de inmunohistoquímica versátil para la expresión de la proteína revelador en el desarrollo del cerebro y de adultos. Mediante el uso de este enfoque, los patrones de expresión complejos moleculares pueden ser analizados y la topografía del cerebro apreciado sin la necesidad de laborioso y procedimientos que consumen tejidos de seccionamiento. Este protocolo se ha utilizado para rev...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiales </td><td> Función en el protocolo </td></tr><tr><td> La perfusión de la bomba (Fisher Scientific/13-876-2) </td><td> Permite la perfusión constante y lento. </td></tr><tr><td> Sharp-Tijeras de punta (FST/14081-08) </td><td> De uso general en la perfusión y la disección. </td></tr><tr><td> Blunt punta Pinzas (FST/91100-12) </td><td> Para estabilizar el corazón para la inserción de la aguja de perfusión. </td></tr><tr><td> Pinzas (FST por Dumont AA/11210-10) </td><td> Para su uso durante la disección del cerebro del cráneo y de separar el cerebelo del resto del cerebro. Estos son esenciales porque tienen una punta ligeramente redondeada que ayuda a minimizar el daño en el cerebelo durante la disección. </td></tr><tr><td> Nutator (Fisher Scientific) </td><td> Se utiliza para mantener el tejido en movimiento durante los períodos de incubación. </td></tr><tr><td> 1,5 ml tubo (Sarstedt / Tornillo Micro Tube) </td><td> Todos los pasos del suinmunohistoquímica protocolo llevará a cabo en estos microtubos. La parte inferior redondeada asegura que el cerebelo permanece en movimiento. </td></tr><tr><td> Una cuchara perforada (FST/10370-17) </td><td> Se utiliza para mantener wholemounts en los microtubos mientras que suavemente decantar la solución pasó. </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA microscopio </td><td> Se utiliza para examinar las manchas wholemount. </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX cámara </td><td> Se utiliza para capturar imágenes wholemount. </td></tr></tbody></table> Tabla 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="9"> Ejemplo de calendario para un experimento típico de wholemount </td></tr><tr><td> Día 1 </td><td colspan="4"> Dent solución, la temperatura ambiente, 8 horas </td><td colspan="4"> Dent lejía, 4 ° C, durante la noche </td></tr><tr><td> Día 2 </td><td colspan="3"> 100% de MeOH, temperatura ambiente, 2x, 30 minutos cada uno </td><td colspan="3"> 100% MeOH, congelación / descongelación, 4x, 30 min min/15 </td><td colspa<html> n = &quot;2&quot;&gt; 100% de MeOH, -80 ° C, durante la noche </td></tr><tr><td> Día 3 </td><td> 50% MeOH/50% PBS, a temperatura ambiente, 60-90 min </td><td colspan="2"> 15% de MeOH / 85% de PBS, a temperatura ambiente, 60-90 min </td><td colspan="2"> 100% de PBS, a temperatura ambiente, 60-90 min </td><td> 10μg/mL Proteinasa K en PBS, a temperatura ambiente, 2-3 min </td><td> 100% de PBS, a temperatura ambiente, 3x, 10 minutos cada uno </td><td> PMT, 4 º C, durante la noche </td></tr><tr><td> Día 4-5 </td><td colspan="8"> PMT + 1 ° de anticuerpos + 5% de DMSO, 4 ° C, 48 horas </td></tr><tr><td> Día 6 </td><td colspan="3"> PMT, 4 ° C, 2-3X, 2-3 horas cada uno </td><td colspan="5"> PMT + 2 ° de anticuerpos + 5% de DMSO, 4 ° C, 24 horas (o empezar los pasos de amplificación con complejo ABC) </td></tr><tr><td> Día 7 </td><td colspan="2"> PMT, 4 ° C, 2-3X, 2-3 horas cada uno </td><td colspan="3"> PBT, temperatura ambiente, 2 hrs </td><td colspan="3"> Incubar en DAB fresco en PBS hasta que la tinción óptima se visualiza </td></tr></tbody></table>_content &quot;&gt; Tabla 2. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Recetas (* = preparar fresca cada vez) </td></tr><tr><td> PBS (tampón fosfato salino) </td><td> 0,1 M tampón fosfato salino en agua desionizada. pH 7,2 (Sigma; tabletas P4417) </td></tr><tr><td> PFA (paraformaldehído) </td><td> Fabricado y congelado almacenado como una solución al 20% y después se diluyó a 4% en PBS durante la solución de trabajo (Fisher Scientific; T353) </td></tr><tr><td> Dent fijadora de 3 * </td><td> 4 partes de metanol 1 parte de dimetilsulfóxido (DMSO, Fisher Scientific, D159-4) </td></tr><tr><td> Dent Bleach 3 * </td><td> 4 partes de metanol 1 parte de dimetilsulfóxido (DMSO, Fisher Scientific, D159-4) 1 parte de hidrógeno al 30% de peróxido </td></tr><tr><td> La digestión enzimática </td><td> 10 ug / ml de proteinasa K (Roche Diagnostics; 03115828001) en PBS. </td></tr><tr><td> PBST </td><td> PBS que contenía: 0,1% de Tween-20 (Fisher científico, BP337; Tritón también se puede utilizar en lugar de Tween-20 en todos los casos). </td></tr><tr><td> PMT 25 * </td><td> PBS que contenía: 2% de grasa de leche en polvo descremada (Clavel prefiere) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) </td></tr><tr><td> PBT 25 * </td><td> PBS que contenía: 0,2% de albúmina sérica bovina (Sigma; B9001S) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) </td></tr><tr><td> DAB * </td><td> Disuelva una tableta de 10 mg de 3,3-diaminobencidina (Sigma-Aldrich, D5905) en 40 ml de PBS. Añadir 10 l de peróxido de hidrógeno al 30% para iniciar la reacción). </td></tr><tr><td> ABC Complejo Solución </td><td> Vectastain kit (Vector Laboratories, Inc, PK-4000) </td></tr></tbody></table> Tabla 3.

wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography

La arquitectura repetida y bien entendido-celular del cerebelo lo convierten en un sistema modelo ideal para explorar la topografía cerebral. Detrás de su citoarquitectura relativamente uniforme es un complejo conjunto de dominios parasagitales de expresión génica y proteica. La compartimentación molecular del cerebelo se refleja en la organización anatómica y funcional de las fibras aferentes. Para apreciar plenamente la complejidad de la organización del cerebelo que previamente refinado un enfoque tinción wholemount de análisis de alto rendimiento de los defectos de modelado en el cerebelo de ratón. Este protocolo se describe en detalle los reactivos, instrumentos y medidas prácticas que son útiles para revelar los patrones de éxito de expresión de proteínas en el cerebelo de ratones adultos mediante el uso de inmunotinción wholemount. Los pasos resaltada aquí demuestran la utilidad de este método que utiliza la expresión de zebrinII / aldolaseC como un ejemplo de cómo la topografía fino del cerebro puede ser revelada en sunativo conformación tridimensional. También se describen las adaptaciones del protocolo que permite la visualización de expresión de la proteína en las proyecciones aferentes y cerebelo, sin limitación para los estudios comparativos de la topografía molecular. Para ilustrar estas aplicaciones, los datos de tinción aferente del cerebelo de rata están incluidos.

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Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Circuitos neuronales están topográficamente organizadas en compartimentos funcionales con determinados perfiles moleculares. Aquí, ofrecemos los pasos prácticos y técnicos para revelar la topografía global del cerebro mediante un método versátil wholemount tinción inmunohistoquímica. Se demuestra la utilidad del método que utiliza la citoarquitectura bien entendida y la circuitería de cerebelo.

La inmunohistoquímica wholemount de Topografía Revelando Complex Brain

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

wholemount-immunohistochemistry-for-revealing-complex-brain-topography

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K vistas.  Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University. Circuitos neuronales están topográficamente organizadas en compartimentos funcionales con determinados perfiles moleculares. Aquí, ofrecemos los pasos prácticos y técnicos para revelar la topografía global del cerebro mediante un método versátil wholemount tinción inmunohistoquímica. Se demuestra la utilidad del método que utiliza la citoarquitectura bien entendida y la circuitería de cerebelo.

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The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

En la zona subventricular cara: tinción wholemount y flujo ependimarios

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Investigación

Neurociencias

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

Revelando la topografía del circuito neuronal en el Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en larvas lamprea de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Implantación crónica de todo cortical matriz electrocorticográfica en el tití común

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Evaluación de la inducción a largo plazo de la depresión en rodajas de cerebelosores adultos

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...