Este protocolo es significativo ya que muestra una metodología paso a paso para aislar epitelio uterino altamente puro del útero de ratón para el cultivo de organoides endometriales. Este método utiliza eficientemente la disociación enzimática y mecánica para aislar el epitelio uterino. Las técnicas se simplificaron para establecer, tratar y analizar organoides del epitelio endometrial derivados del epitelio aislado.
Comience descongelando la matriz de gel en hielo durante aproximadamente una o dos horas antes de usarla. Luego disecciona al ratón sacrificado haciendo una incisión en la línea media en el abdomen con tijeras y pelando suavemente la piel para exponer la capa peritoneal subyacente. Localice los cuernos uterinos moviendo suavemente las almohadillas de grasa abdominal a un lado y sostenga los cuernos uterinos en la unión cervical antes de cortarlos a lo largo de la grasa mesentérica.
Después de la disección del útero del ratón, retire completamente el tejido graso del cuerno uterino con tijeras pequeñas. Una vez hecho esto, corte cada cuerno uterino en pequeños fragmentos, cada uno mide aproximadamente cuatro a cinco milímetros. Coloque todos los fragmentos uterinos de un útero en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga 0,5 mililitros de tripsina al 1%.
Luego incube la placa de 24 pocillos en una incubadora de cultivo de tejido humidificado de 37 grados centígrados durante aproximadamente una hora para la separación enzimática del epitelio endometrial del estroma subyacente. Después de la incubación, transfiera los fragmentos uterinos a una placa de cultivo de tejido de 35 milímetros que contenga un mililitro de solución tamponada de fosfato de Dulbecco o DPBS. Luego, separe el epitelio uterino de la trompa uterina bajo un microscopio de disección sosteniendo un extremo de un fragmento uterino con los fórceps y pasando suavemente la punta de la pipeta longitudinalmente a través del fragmento, apretando el epitelio fuera del otro extremo de la trompa uterina.
Luego observe las hojas epiteliales separadas del fragmento uterino bajo el microscopio de disección. A continuación, transfiera suavemente todas las láminas epiteliales al mismo tubo de 1,5 mililitros con la pipeta de un mililitro. Y granular las láminas epiteliales disociadas por centrifugación a 375 x g durante cinco minutos.
Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet celular y vuelva a suspender el pellet celular en 0,5 mililitros de 2,5 miligramos por mililitro de colagenasa más dos miligramos por mililitro de solución de ADN. Pipetear hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces o hasta que se logre una suspensión de una sola célula. A continuación, agregue 0.5 mililitros de DMEM F / 12 más 10% de suero bovino fetal o FBS más antibióticos y centrifugue las células durante cinco minutos a 375 x g.
Retire el sobrenadante, resuspenda las células en un mililitro DMEM / F12 más 10% FBS más antibióticos y centrifugue las células. Coloque la matriz de gel en hielo hasta que esté lista. A continuación, retire el sobrenadante de las células centrífugas y resuspenda el pellet celular utilizando 20 veces el volumen de la matriz de gel sin introducir las burbujas.
Deje que la suspensión de células de matriz de gel se asiente a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Una vez que la suspensión de células de matriz de gel se convierta en un gel semisólido, use una micropipeta P200 con una punta de 200 microlitros de diámetro ancho y aspire suavemente 25 microlitros de la suspensión de células de matriz de gel. Dispense tres domos separados de 25 microlitros por pocillo de una placa de 12 pocillos y permita que la matriz de gel se cure durante 15 minutos y una incubadora de cultivo de tejido humidificado de 37 grados centígrados.
Después de curar la matriz de gel, agregue 750 microlitros de medio organoide a cada cúpula de matriz de gel que contenga pocillos, e incubador a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados. Las imágenes de contraste de fase de organoides endometriales de ratón mostraron que la separación de células epiteliales y estromales produjo muestras con no más del 10% al 15% de contaminación del tipo de célula opuesta. Las células epiteliales endometriales se ensamblaron en organoides en tres o cuatro días.
Los organoides endometriales fijados en parafina con formol seccionados se visualizaron mediante tinciones de hematoxilina y eosina, que mostraban la capa única de epitelio y centros huecos, los lúmenes de los organoides. Las imágenes de microscopio de fluorescencia mostraron que todas las células en los organoides eran positivas para citoqueratina 8 y contenían DAPI, lo que indica que la fijación, incrustación y procesamiento de los organoides endometriales es compatible con la inmunotinción basada en anticuerpos. La PCR cuantitativa en tiempo real mostró que la estimulación con 10 nanomolares de estradiol aumentó la expresión de lipocalina 2, lactoferrina y receptor de progesterona en los organoides epiteliales, lo que indica que los organoides epiteliales endometriales se pueden utilizar con éxito para medir los cambios en la expresión génica en respuesta al estradiol.
Es importante asegurarse de que se obtenga una separación clara del epitelio endometrial durante la etapa de disociación mecánica. Uno debe ser capaz de observar el epitelio emergiendo de la trompa uterina. Otros métodos incluyen el establecimiento de los organoides epiteliales por encapsulación en una matriz de gel.
Si se desea, el compartimiento estromal se puede digerir aún más para crear cocultivos estromales epiteliales 3D. El método puede ayudar a responder preguntas sobre las señales que controlan la renovación del endometrio. Podría ayudar a tratar enfermedades en las mujeres, como la endometriosis, la pérdida del embarazo y el cáncer.
