当社のプロトコルは、特殊な機器を使用せずに、既知の抗生物質の費用対効果とタイムリーな非レプリケーションの両方を可能にするため、重要です。この手法の主な利点は、テンプレートのカスタマイズです。これは、個人が広いまたは狭い基質特異性の所望のレベルに基づいて、彼らのライブラリテンプレートに含めたい抵抗遺伝子を調整できることを意味します。
例えば、β-ラクタムは、β-ラクタムとその様々なサブクラスの高度に特異的な逆複製を可能にするために、大腸菌テンプレートを発現する。敗血症技術を使用して、ピペット500マイクロリットルのカチオンは、無菌貯蔵所から滅菌の各ウェルにMHBを調整し、96深いウェルプレートを調整した。準備されたARPまたはMARP歪みプレートで、ARPまたはMARPマップに従って96深いウェルプレートを接種するためにアプリケータスティックを使用してください。
深いウェルプレートの表面に通気性の密閉膜を置き、摂氏37度、250 RPMで一晩インキュベートします。汚染された井戸がないことを確認します。マルチチャンネルピペットを使用して、深いウェルプレートの各ウェルから滅菌96ウェルラウンドボトムプレートに100マイクロリットルを移します。
各ウェルに無菌50%グリセロールの100マイクロリットルを加え、上下に軽くピペットで混ぜます。少なくとも5つの図書館の版を準備する。滅菌アルミニウムシールでプレートを覆い、各ウェルが個別に密封されていることを確認します。
プレートの蓋をアルミニウムシールの上に置き、マイナス80度で保管します。木製のアプリケータースティックを使用して、ストレプトマイセスコロニーの表面から胞子をそっと削り取り、1つの無菌ガラスビーズと3ミリリットルのストレプトマイス抗生物質培地を含む試験管に移します。試験管をキャップでゆるく閉じて、エアーレーションを可能にします。
同じ木製アプリケータースティックを使用して、ベネットの寒天を含むペトリ皿に不妊手術をストリーク。250 RPMで6日間、滅菌対照プレートを摂氏30度で6日間、摂氏30度で種子培養を含むチューブをインキュベートします。次に、レベルサーフェスで、レプリケーション解除プレートを準備します。
暖かいベネットの寒天の23ミリリットルを血清ピペットに吸い込み、長方形のペトリ皿の表面を均等に20ミリリットル分配し、残りの培地をピペットに残して気泡の形成を防ぎます。蓋をしてプレートを覆います。プレートの全領域にメディアが覆われ、寒天が完全に設定されるまで邪魔しないようにプレートをそっと回転させます。
次に、シートがデレプリケーションプレートの表面に合うように、長方形のペトリ皿蓋をトレーシングテンプレートとして使用してニトロセルロース膜シートを調製します。シートを切り、無菌ポーチにオートクレーブします。さて、6日間のインキュベーションの後に汚染物質が存在しないように、滅菌制御プレートを確認してください。
汚染のない場合は、長方形のペトリ皿とピペット200マイクロリットルの種子培養液の蓋を、長方形の皿のベネットの寒天の表面に取り除きます。滅菌綿棒を使用して、プレート全体の表面に均等に培養を広げます。ペトリ皿の表面上の培養物の上に準備されたニトロセルロース膜を配置するには、膜の下端をペトリ皿の下端に合わせ、膜を下端からプレートの上端にゆっくりと塗布します。
無菌綿棒を使用して、膜寒天界面の間に形成された可能性のある気泡を滑らかにし、膜が寒天にフラッシュされるようにします。膜は、二次代謝産物が下の媒体に排泄され得る間、生物がその表面上で胞子を散発することを可能にする。蓋を長方形のペトリ皿に戻し、密閉されたビニール袋に逆さまに置きます。
摂氏30度で6日間インキュベートします。6 日後、インキュベーターからデレプリケーションプレートを取り外します。滅菌ピンセットを使用して、慎重にベネットの寒天の表面からニトロセルロース膜を除去します。
追加するオーバーレイを汚染する可能性を減らすには、プレートの端の周りにわずかな胞毛の成長が存在することを確認してください。作業面がレベルであることを確認し、血清学的ピペットを使用して23ミリリットルの暖かいカチエイト調整されたMHB寒天を吸引します。空気泡の形成を防ぐために、配管に寒天の残りの部分を残して、20ミリリットルを均等にデズリングして、重ね合わせを作成します。
蓋をプレートに置きます。プレートを、中程度の部分が覆い、寒天が完全に設定されるまで邪魔しないようにします。冷却して固まったら、デレプリケーションプレートを密閉されたビニール袋に戻し、一晩摂氏4度で逆さまに保管し、MHB寒天オーバーレイへの二次代謝物の拡散を可能にします。
同じ日に、最初に100マイクロリットルのカチオン調整MHBを96ウェルプレートの各ウェルにピペット化して、新鮮なARPまたはMARPテンプレートを接種します。氷のストックARPまたはMARPライブラリプレートをマイナス80°Cの冷凍庫から取り出します。縮合が下側に形成され始める前に、アルミニウムシールを取り外します。
滅菌96ウェルピン留めツールを使用して、冷凍ストックARPまたはMARPライブラリプレートから慎重にピン留めし、96ウェルプレートを含む新鮮なMHBを接種します。レプリケーション解除時の汚染を最小限に抑えるには、ライブラリプレートごとに2~3個のレプリケーション解除プレートの複製を解除するために必要なARPまたはMARPライブラリプレートを多数用意します。完了したら、冷凍テンプレートに新しい滅菌アルミニウムシールを入れ、マイナス80°C冷凍庫に戻します。
緩く密封されたビニール袋の中に接種された96ウェルプレートを入れ、250 RPMで18時間揺れで摂氏37度でインキュベートします。インキュベーターから ARP または MARP テンプレートを削除し、プレートを ARP または MARP テンプレート マップと比較して汚染物質が存在しないようにします。4°Cからデレプリケーションプレートを取り外し、室温に平衡化することができます。
結露がある場合は、蓋を開け、滅菌環境で乾燥させます。無菌ピン留めツールを使用して、ARPまたはMARPライブラリプレートから、複製解除プレートのMHB寒天オーバーレイの表面にピン留めします。寒天を突き刺さないで
テンプレートの接種を3〜5分間乾燥させます。接種された非複製プレートを密閉されたビニール袋に逆さまに入れ、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、デレプリケーション プレートの成長を ARP または MARP マップに対応するウェルと比較して、レプリケーションデレプリケーション結果を分析します。
この ARP または MARP レプリケーション解除ワークフローでは、正のレプリケーション解除結果が得られました。ここで株WAC 8921のために調製された抽出物はクロラムフェニコール生産者として同定された。ARPの成長の欠如は、未知の抗生物質またはARPまたはMARPライブラリプレートで考慮されなかったあまり一般的に見つかった抗生物質の存在を示す。
MARPに特有の成長パターンは、野生型大腸菌BW25113とハイパー透過性およびeフラックス欠損変異体E.coli BW25113 bamB tolCの両方の利用のために形成された。この結果は、無傷の外膜を超えることができなかった抗菌活性を有する化合物の存在を示唆している。この大腸菌の成長パターンは、ピン留めツールの不適切な滅菌を示唆し、その結果、未知の大腸菌株がオーバーレイ全体に伝達される。
そして、ARPまたはMARP冷凍ストックライブラリプレート汚染の例は、長方形のペトリ皿表面に成長した3つの異なる大腸菌コロニーをここで示しています。この結果は、レプリケーション解除中に寒天オーバーレイがピアスされたことを示します。MHBオーバーレイ関連の汚染は、デレプリケーションプロセス中にも発生する可能性があります。
このプロトコルに従うときに覚えておくべきことは、汚染のために任意のステップで抑えきれないようにするために、適切な殺菌と無菌技術を使用することです。これには、MHBオーバーレイを流す際の胞子の広がりを最小限に抑えるために、ベネットの寒天板の表面にできるだけ近づくようにニトロセルロース膜を準備することが含まれます。さらに、最もクリーンな結果を生み出すためには、ライブラリプレートを接種し、脱複製する際に適切に滅菌されたピン留め装置を使用することも非常に重要です。
既知の抗生物質の脱複製に加えて、この方法は、既存の抗生物質と組み合わせて使用できる補助剤を同定して活動を救うことができる。抗生物質のデレプリケーションは新しい技術ではありませんが、リソースを大量に消費し、時間がかかることで悪名高いです。ARPおよびMARPプラットフォームは、抗生物質のデレプリケーションが大規模な生産である必要はないが、最小限の装置を使用して2週間にわたって完了できる方法に光を当てるのに役立ちます。
