بروتوكولنا مهم لأنه يسمح بكل من المضادات الحيوية المعروفة فعالة من حيث التكلفة وفي الوقت المناسب دون استخدام المعدات المتخصصة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تخصيص القالب. وهذا يعني أن الفرد يمكن أن خياط الجينات المقاومة التي يرغبون في إدراجها في قالب مكتبتهم على أساس المستوى المطلوب من خصوصية الركيزة واسعة أو ضيقة.
على سبيل المثال، بيتا لاكتام هو التعبير عن E.coli القالب يمكن أن تكون مستعدة للسماح للتخريب محددة للغاية من بيتا لاكتام والفئات الفرعية المختلفة. باستخدام تقنية الصرف الصحي، الماصات 500 ميكرولترات من الموجبة ضبط MHB من خزان معقمة في كل بئر من صحن بئر معقمة، 96 عميق. مع إعداد ARP أو لوحات سلالة MARP، استخدم عصا قضيب لتطعيم 96 لوحة بئر عميق وفقا لخريطة ARP أو MARP.
ضع غشاء قابل للتنفس على سطح لوحة البئر العميقة وحضنها بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، 250 دورة في الدقيقة. ضمان عدم وجود آبار ملوثة. باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 100 ميكرولترات من كل بئر من لوحة البئر العميق إلى لوحة 96-جيدا 96 جولة أسفل.
إضافة 100 ميكرولتررس من الجلسرين 50٪ معقمة في كل بئر ومزيج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. إعداد ما لا يقل عن خمسة لوحات المكتبة. تغطية لوحات مع الأختام الألومنيوم العقيمة وضمان أن كل بئر مختومة بشكل فردي.
ضع غطاء اللوحة على أعلى ختم الألومنيوم واخزنه عند درجة حرارة 80 درجة مئوية. باستخدام عصا قضيب خشبية، كشط بلطف الجراثيم من سطح مستعمرة ستريبتومسي ونقلها إلى أنبوب اختبار يحتوي على حبة زجاجية معقمة واحدة وثلاث ملليلترات من المضادات الحيوية الستربتاويس المتوسطة. أغلق أنبوب الاختبار بشكل فضفاض بغطاء للسماح بالتهيّم.
باستخدام نفس عصا قضيب خشبية، خط سيطرة العقم على طبق بيتري تحتوي على أجار بينيت. احتضان أنبوب يحتوي على البذور ثقافة في 30 درجة مئوية مع تهيّم لمدة ستة أيام في 250 دورة في الدقيقة ولوحة التحكم في العقم في 30 درجة مئوية لمدة ستة أيام. ثم، على سطح مستوى، وإعداد لوحات dereplication.
سبيرات 23 ملليلتر من أجار بينيت الدافئة في ماصة المصلية والاستغناء 20 ملليلتر بالتساوي عبر سطح طبق بيتري مستطيلة، وترك ما تبقى من المتوسطة في الماصات لمنع تشكيل فقاعة الهواء. غطي الطبق بغطاء. تدوير لوحة بلطف حتى يغطي المتوسطة جميع المناطق من لوحة وعدم إزعاج ذلك حتى agar قد وضعت تماما.
بعد ذلك، إعداد أوراق الأغشية nitrocellulose باستخدام غطاء طبق بيتري مستطيلة كقالب تتبع بحيث أن الأوراق تناسب سطح لوحة dereplication. قطع الأوراق وautoclave لهم في الحقيبة العقيمة. الآن، تحقق من لوحة التحكم في العقم للتأكد من عدم وجود أي ملوثات بعد ستة أيام من الحضانة.
إذا خالية من التلوث، وإزالة غطاء طبق بيتري مستطيلة وماصة 200 ميكرولترات من ثقافة البذور على سطح أجار بينيت في الطبق المستطيل. استخدام مسحة القطن العقيمة لنشر الثقافة بالتساوي عبر سطح لوحة كاملة. لوضع الغشاء النيتروسليلوز المعدة على قمة الثقافة على سطح طبق بيتري، محاذاة الحافة السفلية للغشاء إلى الحافة السفلية من طبق بيتري وتطبيق الغشاء ببطء من الحافة السفلية إلى الحافة العليا من لوحة.
استخدام مسحة القطن العقيمة لتنعيم أي فقاعات الهواء التي قد تكون تشكلت بين واجهة أجار غشاء، وضمان أن الغشاء هو تدفق إلى أجار. يسمح الغشاء للكائنات الحية بsporulate على سطحه في حين يمكن أن تفرز الأيض الثانوية في الوسط أدناه. ضع الغطاء مرة أخرى على طبق بيتري المستطيل وضعه رأسًا على عقب في كيس بلاستيكي مغلق.
احتضان في 30 درجة مئوية لمدة ستة أيام. بعد ستة أيام، قم بإزالة لوحة إزالة الخلع من الحاضنة. باستخدام ملاقط معقمة، وإزالة بعناية الغشاء النيتروسليلوز من سطح أجار بينيت.
تأكد من أن هناك فقط نمو spore طفيفة حول حواف لوحة لتقليل فرص تلويث تراكب أن تضاف. ضمان سطح العمل هو مستوى واستخدام ماصة المصلية لpirate 23 ملليلتر من الحارة الموجبة تكييفها MHB أجار. إنشاء تراكب عن طريق الاستغناء 20 ملليلتر بالتساوي عبر سطح لوحة dereplication، وترك ما تبقى من أجار في ماصة لمنع تشكيل فقاعة الهواء.
ضع الغطاء على الصحن. تدوير لوحة بلطف حتى يغطي المتوسطة جميع المناطق وعدم إزعاجه حتى تم تعيين أجار تماما. مرة واحدة تبريد وتوطدت، والعودة لوحة dereplication إلى كيس من البلاستيك مختومة وتخزينها رأسا على عقب في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها، مما يسمح لنشر الأيض الثانوية في تراكب أجار MHB.
في نفس اليوم ، تلقيح ARP جديد أو قالب MARP عن طريق الأنابيب الأولى 100 microliters من الموجبة تعديل MHB في كل بئر من لوحة 96-well. خذ المخزون المجمد ARP أو لوحة مكتبة MARP من الفريزر ناقص 80 درجة مئوية. إزالة ختم الألومنيوم قبل أن يبدأ التكثيف في تشكيل على الجانب السفلي.
باستخدام أدوات معقمة 96 جيدا تعلق، دبوس بعناية من المخزون المجمدة ARP أو لوحة مكتبة MARP وتطعيم MHB الطازجة التي تحتوي على لوحات 96-جيدا. لتقليل التلوث أثناء إزالة ا للتسرب، قم بإعداد العديد من لوحات مكتبة ARP أو MARP اللازمة فقط لتخريب اثنين إلى ثلاثة لوحات إلغاء replication لكل لوحة مكتبة. بمجرد اكتمالها، ضع ختم ألمنيوم معقمة جديدة على القالب المجمد وإعادته إلى الفريزر ناقص 80 درجة مئوية.
ضع لوحات 96-well الملقح داخل كيس بلاستيكي مختوم بشكل فضفاض وحضن في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة. قم بإزالة قالب ARP أو MARP من الحاضنة وتأكد من عدم وجود أي ملوثات من خلال مقارنة اللوحة بخريطة قالب ARP أو MARP. إزالة لوحات dereplication من أربع درجات مئوية والسماح لتكواز درجة حرارة الغرفة.
إذا كان هناك تكثيف، فتح الأغطية والسماح لتجف في بيئة معقمة. باستخدام أدوات التثبيت العقيمة، دبوس من لوحة مكتبة ARP أو MARP على سطح تراكب أجار MHB من لوحات dereplication. يجب الحرص على عدم اختراق أجار.
السماح للقوالب inoculum لتجف لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. ضع لوحات الهريبوليكية الملقسة مقلوبة في كيس بلاستيكي مختوم وحضن بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، تحليل نتائج dereplication بمقارنة النمو على لوحة dereplication إلى الآبار التي تتوافق مع ARP أو خريطة MARP.
في هذا ARP أو MARP إزالة سير العمل، تم تحقيق نتيجة إزالة موجبة. حيث تم تحديد استخراج أعدت لسلالة WAC 8921 كمنتج الكلورافينيكول. عدم وجود نمو ARP يشير إلى وجود مضاد حيوي غير معروف أو مضاد حيوي أقل شيوعًا لم يتم حسابه في لوحة مكتبة ARP أو MARP.
وقد تشكل نمط نمو فريد من نوعه لـ MARP بسبب استخدامه لكل من النوع البري E.coli BW25113 وفرط نفاذية وتدفق إلكتروني مُتحول ناقص E.coli BW25113 bamB tolC. تشير هذه النتيجة إلى وجود مركب مع نشاط مضاد للميكروبات لم يتمكن من تجاوز الغشاء الخارجي السليم. تشير أنماط نمو الإشريكية القولونية هذه إلى التعقيم غير السليم لأدوات التثبيت ، مما يؤدي إلى نقل سلالات الإشريكية القولونية غير المعروفة عبر التراكب.
ومثال على ARP أو MARP تجميد مكتبة الأسهم يظهر التلوث هنا مع ثلاث مستعمرات القولونية متميزة نمت على سطح طبق بيتري مستطيلة. تشير هذه النتيجة إلى أن تراكب agar قد تم اختراقه أثناء إلغاء replication. ويمكن أن يحدث التلوث المتصل بتراكب MHB أثناء عملية إزالة التكاء، مما يظهر نمط نمو غير منتظم على سطح التراكب.
أهم شيء أن نتذكر عند اتباع هذا البروتوكول هو استخدام التعقيم السليم والتقنيات العقيمة من أجل ضمان أن كنت لا تعقد مرة أخرى في أي خطوة بسبب التلوث. وهذا يشمل إعداد الغشاء النيتروسليلوز بحيث يناسب سطح لوحة أجار بينيت في أقرب وقت ممكن من أجل الحد من انتشار الجراثيم عند صب تراكب MHB. بالإضافة إلى ذلك، من المهم للغاية أيضا استخدام معدات تثبيت معقمة بشكل صحيح عند تلقيح لوحات المكتبة وتسريب من أجل إنتاج أنظف نتيجة.
بالإضافة إلى إزالة المضادات الحيوية المعروفة، يمكن تطبيق هذه الطريقة لتحديد المواد المساعدة التي يمكن استخدامها بالاقتران مع المضادات الحيوية الموجودة لإنقاذ نشاطها. على الرغم من أن إزالة المضادات الحيوية ليست تقنية جديدة ، إلا أنها سيئة السمعة لكونها كثيفة الموارد وتستغرق وقتًا طويلاً. تساعد منصة ARP و MARP على تسليط الضوء على كيفية عدم الحاجة إلى أن يكون إزالة المضادات الحيوية إنتاجًا كبيرًا ، ولكن يمكن إكماله على مدى أسبوعين باستخدام الحد الأدنى من المعدات.
