Unser Protokoll ist von Bedeutung, da es sowohl die kostengünstige als auch die rechtzeitige Dereplikation bekannter Antibiotika ohne den Einsatz spezieller Geräte ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Vorlagenanpassung. Dies bedeutet, dass eine Person auf der Grundlage ihrer gewünschten breiten oder schmalen Substratspezifität die Resistenzgene, die sie in ihre Bibliotheksvorlage aufnehmen möchten, individuell anpassen kann.
Zum Beispiel kann eine Beta-Lactam-Exemittierung E.coli-Vorlage vorbereitet werden, um die hochspezifische Dereplikation von Beta-Lactamen und ihren verschiedenen Unterklassen zu ermöglichen. Mit einer septischen Technik, Pipette 500 Mikroliter Kation angepasst MHB aus einem sterilen Reservoir in jeden Brunnen einer sterilen, 96 tiefen Brunnenplatte. Verwenden Sie mit den vorbereiteten ARP- oder MARP-Dehnungsplatten einen Applikatorstab, um die 96-Tiefe-Bohrplatte gemäß der ARP- oder MARP-Karte zu impfen.
Legen Sie eine atmungsaktive Dichtmembran auf die Oberfläche der Tiefenbrunnenplatte und bebrüten Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius, 250 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass keine kontaminierten Brunnen vorhanden sind. Mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter aus jedem Brunnen der Tiefbrunnenplatte auf eine sterile 96-Well-Rundbodenplatte übertragen.
Fügen Sie 100 Mikroliter steriles 50%Glycerin in jeden Brunnen und mischen Sie, indem Sie sanft nach oben und unten. Bereiten Sie mindestens fünf Bibliotheksplatten vor. Bedecken Sie die Platten mit sterilen Aluminiumdichtungen und sorgen Sie dafür, dass jeder Brunnen einzeln versiegelt ist.
Legen Sie den Plattendeckel auf die Aluminiumdichtung und lagern Sie bei minus 80 Grad Celsius. Mit einem hölzernen Applikatorstab sporen Sie vorsichtig von der Oberfläche einer Streptomyces-Kolonie ab und überträgt sie in ein Reagenzglas mit einer sterilen Glasperle und drei MilliliterStreptomyces Antibiotikum- Schließen Sie das Reagenzglas locker mit einer Kappe, um die Belüftung zu ermöglichen.
Mit dem gleichen hölzernen Applikator-Stick, streifen Sie eine Sterilitätskontrolle auf einer Petrischale mit Bennetts Agar. Inkubieren Sie die Röhre mit Samenkultur bei 30 Grad Celsius mit Belüftung für sechs Tage bei 250 U/min und die Sterilitätskontrollplatte bei 30 Grad Celsius für sechs Tage. Bereiten Sie dann auf einer ebenen Oberfläche Dereplikationsplatten vor.
23 Milliliter warmen Bennett-Agar in eine serologische Pipette aspirieren und 20 Milliliter gleichmäßig über die Oberfläche einer rechteckigen Petrischale verteilen, so dass der Rest des Mediums in der Pipette bleibt, um luftblasenbildung zu verhindern. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel. Drehen Sie die Platte vorsichtig, bis das Medium alle Bereiche der Platte abdeckt und sie nicht stört, bis der Agar vollständig eingestellt ist.
Als nächstes bereiten Sie Nitrozellulose-Membranplatten mit einem rechteckigen Petrischalendeckel als Tracing-Vorlage vor, damit die Platten auf die Oberfläche der Dereplikationsplatte passen. Schneiden Sie die Blätter und autoklavieren Sie sie in einem sterilen Beutel. Überprüfen Sie nun die Sterilitätskontrollplatte, um sicherzustellen, dass nach sechs Tagen Inkubation keine Verunreinigungen vorhanden sind.
Wenn kontaminationsfrei, entfernen Sie den Deckel der rechteckigen Petrischale und Pipette 200 Mikroliter der Samenkultur auf die Oberfläche des Bennett-Agars in der rechteckigen Schale. Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um die Kultur gleichmäßig über die Oberfläche der gesamten Platte zu verteilen. Um die vorbereitete Nitrocellulosemembran über der Kultur auf der Oberfläche der Petrischale zu positionieren, richten Sie den unteren Rand der Membran am unteren Rand der Petrischale aus und wenden Sie die Membran langsam vom unteren Rand bis zum oberen Rand der Platte an.
Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um Luftblasen zu glätten, die sich zwischen der Membran-Agar-Schnittstelle gebildet haben könnten, um sicherzustellen, dass die Membran bündig zum Agar ist. Die Membran ermöglicht es Organismen, auf ihrer Oberfläche zu sporulaten, während sekundäre Metaboliten in das Medium unten ausgeschieden werden können. Legen Sie den Deckel wieder auf die rechteckige Petrischale und legen Sie ihn auf den Kopf in eine versiegelte Plastiktüte.
Sechs Tage lang bei 30 Grad Celsius brüten. Entfernen Sie nach sechs Tagen die Dereplikationsplatte aus dem Inkubator. Entfernen Sie mit steriler Pinzette vorsichtig die Nitrocellulosemembran von der Oberfläche des Bennett-Agars.
Stellen Sie sicher, dass es nur ein geringes Sporenwachstum an den Rändern der Platte gibt, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination der zu verwendenden Überlagerung zu verringern. Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsfläche eben ist, und verwenden Sie eine serologische Pipette, um 23 Milliliter warmkationsangepassten MHB-Agar saugen zu können. Erstellen Sie eine Überlagerung, indem Sie 20 Milliliter gleichmäßig über die Oberfläche der Dereplikationsplatte verteilen, sodass der Rest des Agars in der Pipette bleibt, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.
Legen Sie den Deckel auf die Platte. Drehen Sie die Platte vorsichtig, bis das Medium alle Bereiche abdeckt und stört sie nicht, bis der Agar vollständig eingestellt ist. Nach dem Abkühlen und Erstarren die Dereplikationsplatte in die versiegelte Plastiktüte zurückgeben und über Nacht bei vier Grad Celsius auf den Kopf stellen, so dass sekundäre Metaboliten in die MHB-Agar-Overlay stritten.
Am selben Tag impfen Sie eine frische ARP- oder MARP-Schablone, indem Sie zuerst 100 Mikroliter Kation in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte einteilen. Nehmen Sie die gefrorene NaRP- oder MARP-Bibliotheksplatte aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Entfernen Sie die Aluminiumdichtung, bevor sich auf der Unterseite Kondensation zu bilden beginnt.
Mit sterilen 96-Well-Pinning-Werkzeugen vorsichtig aus dem gefrorenen Lager ARP oder MARP Bibliotheksplatte anheften und die frische MHB mit 96-Well-Platten impfen. Um die Kontamination während der Dereplikation zu minimieren, bereiten Sie so viele ARP- oder MARP-Bibliotheksplatten vor, die nur für die Dereplikation von zwei bis drei Dereplikationsplatten pro Bibliotheksplatte erforderlich sind. Nach Der Fertigstellung eine neue sterile Aluminiumdichtung auf die gefrorene Schablone legen und in den Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius zurückbringen.
Die geimpften 96-Well-Platten in eine lose versiegelte Plastiktüte geben und bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 U/min 18 Stunden bebrüten. Entfernen Sie die ARP- oder MARP-Vorlage aus dem Inkubator, und stellen Sie sicher, dass keine Verunreinigungen vorhanden sind, indem Sie die Platte mit der ARP- oder MARP-Vorlagenkarte vergleichen. Entfernen Sie die Dereplikationsplatten von vier Grad Celsius und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausdemieren.
Wenn es Kondensation gibt, öffnen Sie die Deckel und lassen Sie in einer sterilen Umgebung trocknen. Mit sterilen Pinning-Werkzeugen von der ARP- oder MARP-Bibliotheksplatte auf die Oberfläche der MHB-Agar-Overlay der Dereplikationsplatten. Achten Sie darauf, den Agar nicht zu durchstechen.
Lassen Sie die Vorlage inoculum für drei bis fünf Minuten trocknen. Die geimpften Dereplikationsplatten kopfüber in eine versiegelte Plastiktüte legen und über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Analysieren Sie am nächsten Tag die Dereplikationsergebnisse, indem Sie das Wachstum auf der Dereplikationsplatte mit Bohrungen vergleichen, die der ARP- oder MARP-Karte entsprechen.
In diesem ARP- oder MARP-Dereplikationsworkflow wurde ein positives Dereplikationsergebnis erzielt. Wobei der für den Stamm WAC 8921 hergestellte Extrakt als Chloramphenicol-Produzent identifiziert wurde. Der Mangel an ARP-Wachstum deutet auf das Vorhandensein eines unbekannten Antibiotikums oder eines weniger häufig gefundenen Antibiotikums hin, das nicht in der ARP- oder MARP-Bibliotheksplatte berücksichtigt wurde.
Ein für das MARP einzigartiges Wachstumsmuster wurde aufgrund seiner Verwendung sowohl des Wildentyps E.coli BW25113 als auch eines hyperdurchlässigen und e-flux-defizienten Mutanten E.coli BW25113 bamB tolC gebildet. Dieses Ergebnis deutet auf das Vorhandensein einer Verbindung mit antimikrobieller Aktivität hin, die nicht in der Lage war, eine intakte äußere Membran zu übertreffen. Diese E.coli-Wachstumsmuster deuten auf eine unsachgemäße Sterilisation von Pinning-Werkzeugen hin, was zur Übertragung unbekannter E.coli-Stämme über das Overlay führt.
Und ein Beispiel für ARP oder MARP gefrorene Stock Bibliothek Platte Kontamination wird hier mit drei verschiedenen E.coli Kolonien auf der rechteckigen Petrischale Oberfläche gewachsen gezeigt. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Agar-Overlay während der Dereplikation durchbohrt wurde. Die MHB-Überlagerungskontamination kann auch während des Dereplikationsprozesses auftreten, was ein unregelmäßiges Wachstumsmuster auf der Oberfläche der Überlagerung zeigt.
Das Wichtigste, was Sie bei der Befolgung dieses Protokolls beachten sollten, ist die Verwendung der richtigen Sterilisation und aseptischer Techniken, um sicherzustellen, dass Sie nicht in irgendeinem Schritt aufgrund von Kontamination zurückgehalten werden. Dazu gehört auch die Vorbereitung der Nitrocellulosemembran, so dass sie so eng wie möglich an die Oberfläche der Bennett-Agarplatte passt, um die Ausbreitung von Sporen beim Gießen der MHB-Überlagerung zu minimieren. Darüber hinaus ist es auch äußerst wichtig, bei der Inokulation der Bibliotheksplatten und der Dereplikierung richtig sterilisierte Pinning-Geräte zu verwenden, um das sauberste Ergebnis zu erzielen.
Neben der Dereplikation bekannter Antibiotika kann diese Methode auch zur Identifizierung von Hilfsstoffen eingesetzt werden, die in Verbindung mit bestehenden Antibiotika zur Rettung ihrer Aktivität verwendet werden können. Obwohl die Dereplikation von Antibiotika keine neue Technik ist, ist sie berüchtigt dafür, ressourcenintensiv und zeitaufwändig zu sein. Die ARP- und MARP-Plattform geben auf, wie die Dereplikation von Antibiotika nicht groß sein muss, sondern über einen Zeitraum von zwei Wochen mit minimaler Ausrüstung abgeschlossen werden kann.
