우리의 프로토콜은 전문 장비를 사용하지 않고 알려진 항생제의 비용 효과적이고 시기 많은 복제를 모두 허용하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 템플릿 사용자 지정입니다. 즉, 개인은 광범위하거나 좁은 기판 특이성의 그들의 원하는 수준에 따라 그들의 라이브러리 템플릿에 포함 하고자 하는 저항 유전자를 조정할 수 있습니다.
예를 들어, 베타-락탐은 베타-락탐및 다양한 하위 클래스의 매우 특이적인 복제를 허용하기 위해 E.coli 템플릿을 표현하고 있다. 정화조 기술을 사용하여, 파이펫 500 양의 피펫 은 멸균 저수지에서 멸균 저수지에서 96 깊은 우물 플레이트의 각 우물로 MHB를 조정했다. 준비된 ARP 또는 MARP 스트레인 플레이트를 사용하여 ARP 또는 MARP 맵에 따라 96개의 심층 웰 플레이트를 접종하기 위해 어플리케이터 스틱을 사용합니다.
깊은 우물 판의 표면에 통기성 밀봉 멤브레인을 놓고 섭씨 37도, RPM 250에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 오염된 우물이 없는지 확인하십시오. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 깊은 웰 플레이트의 각 웰에서 멸균 96 웰 바닥 플레이트로 100 마이크로리터를 전송합니다.
멸균 50% 글리세롤 100마이크로리터를 각 웰에 넣고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 섞습니다. 적어도 다섯 개의 라이브러리 플레이트를 준비합니다. 멸균 알루미늄 씰로 플레이트를 덮고 각 우물이 개별적으로 밀봉되도록 하십시오.
플레이트 뚜껑을 알루미늄 씰 위에 놓고 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 나무 어플리케이터 스틱을 사용하여 연쇄상 구균 식민지 표면에서 포자를 부드럽게 긁어 내고 멸균 유리 비드 1개와 연쇄상 구균 항생제 배지 3밀리리터가 들어 있는 시험관으로 옮춥시다. 식기를 허용하기 위해 캡으로 테스트 튜브를 느슨하게 닫습니다.
같은 나무 어플리케이터 스틱을 사용하여 베넷의 한천이 들어 있는 페트리 접시에 멸균 제어를 줄입니다. 종자 배양을 포함하는 튜브를 30°C에서 6일 동안 250RPM에서 6일간, 멸균 대조판은 6일 동안 섭씨 30도에서 배양한다. 그런 다음 평평한 표면에 복제 플레이트를 준비합니다.
따뜻한 베넷의 한천 23밀리리터를 세로지학적 파이펫으로 흡입하고 직사각형 페트리 접시 표면을 가로질러 20밀리리터를 고르게 분배하여 나머지 매체를 파이펫에 남겨두어 기포 형성을 방지합니다. 뚜껑으로 접시를 덮습니다. 중간 매체가 접시의 모든 영역을 커버하고 한천이 완전히 설정 될 때까지 방해하지 않을 때까지 부드럽게 접시를 회전합니다.
다음으로, 직사각형 페트리 접시 뚜껑을 트레이싱 템플릿으로 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 시트를 준비하여 시트가 복제 플레이트의 표면에 맞출 수 있도록 한다. 시트를 자르고 멸균 파우치로 오토클레이브합니다. 이제 6일 간의 배양 후 오염물질이 존재하지 않도록 멸균 제어 판을 확인하십시오.
오염이 없는 경우, 직사각형 페트리 접시와 직사각형 접시에 있는 베넷 의 한고 표면에 종자 문화의 직사각형 페트리 접시와 파이펫 200 마이크로리터의 뚜껑을 제거하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 전체 플레이트 표면에 배양을 고르게 분산시다. 페트리 접시의 표면에 배양의 상단에 준비 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 배치하려면, 페트리 접시의 하단 가장자리에 멤브레인의 하단 가장자리를 정렬하고 천천히 플레이트의 상단 가장자리에 하단 가장자리에서 멤브레인을 적용합니다.
멸균 면봉을 사용하여 멤브레인 천 인터페이스 사이에 형성되었을 수 있는 기포를 부드럽게 하여 멤브레인이 천으로 플러시되도록 합니다. 멤브레인은 유기체가 표면에 포자를 할 수 있도록 허용하고 보조 대사 산물은 아래 매체로 배설 될 수 있습니다. 뚜껑을 직사각형 페트리 접시에 다시 넣고 밀봉된 비닐 봉지에 거꾸로 놓습니다.
6 일 동안 섭씨 30도에서 배양하십시오. 6일 후 인큐베이터에서 분리 플레이트를 제거합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 베넷 의 한천 표면에서 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 조심스럽게 제거하십시오.
추가될 오버레이를 오염시킬 가능성을 줄이기 위해 플레이트 가장자리 주변에 사소한 포자 성장만 있는지 확인하십시오. 작업 표면이 레벨인지 확인하고 serological pipette를 사용하여 23 밀리리터의 따뜻한 양이온 조정 MHB 한고를 흡인시킵니다. 20 밀리리터를 복제 플레이트 표면을 균등하게 분배하여 통레이를 만들고, 나머지 한천을 파이펫에 남겨두어 기포 형성을 방지합니다.
뚜껑을 접시에 놓습니다. 매체가 모든 영역을 덮을 때까지 접시를 부드럽게 회전시키고 한천이 완전히 설정될 때까지 접시를 방해하지 않습니다. 냉각되고 고화되면 복제 판을 밀봉된 비닐 봉지에 반환하고 밤새 섭씨 4도에 거꾸로 보관하여 이차 대사 산물을 MHB 한고 오버레이로 확산시다.
같은 날, 먼저 100 마이크로리터의 양이온을 96웰 플레이트의 각 우물에 조정하여 신선한 ARP 또는 MARP 템플릿을 접종한다. 냉동 재고 ARP 또는 MARP 라이브러리 플레이트를 영하 80도 냉동고에서 꺼내십시오. 응축이 아래쪽에 형성되기 시작하기 전에 알루미늄 씰을 제거하십시오.
멸균 96웰 고정 도구를 사용하여 냉동 재고 ARP 또는 MARP 라이브러리 플레이트에서 조심스럽게 고정하고 96웰 플레이트가 들어있는 신선한 MHB를 접종합니다. 복제 시 오염을 최소화하려면 라이브러리 플레이트당 2~3개의 복제 플레이트만 복제하는 데 필요한 많은 ARP 또는 MARP 라이브러리 플레이트를 준비합니다. 완료되면, 냉동 템플릿에 새로운 멸균 알루미늄 씰을 넣고 영하 80도 냉동고로 반환합니다.
느슨하게 밀봉 된 비닐 봉지 안에 접종 된 96 웰 플레이트를 넣고 섭씨 37도에 인큐베이션을 넣고 18 시간 동안 250 RPM에서 흔들어 놓습니다. 인큐베이터에서 ARP 또는 MARP 템플릿을 제거하고 플레이트를 ARP 또는 MARP 템플릿 맵과 비교하여 오염 물질이 존재하지 않도록 합니다. 섭씨 4도에서 분리 플레이트를 제거하고 실온에 평형할 수 있습니다.
응축이 있는 경우 뚜껑을 열고 멸균 환경에서 건조시키십시오. 멸균 고정 도구를 사용하여 ARP 또는 MARP 라이브러리 플레이트의 핀을 제거 플레이트의 MHB 한고 오버레이 표면에 고정합니다. 한천을 관통하지 않도록 주의하십시오.
템플릿 접종을 3~5분 동안 건조시키십시오. 접종된 복제 플레이트를 밀봉된 비닐 봉지에 거꾸로 놓고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에 배양합니다. 다음 날, 비복제 플레이트의 성장을 ARP 또는 MARP 맵에 해당하는 우물과 비교하여 복제 결과를 분석합니다.
이 ARP 또는 MARP 복제 워크플로에서 양수 복제 결과가 달성되었습니다. 여기서 균주 WAC 8921에 대해 제조된 추출물은 클로람페니콜 생산자로 확인되었다. ARP 성장의 부족은 ARP 또는 MARP 도서관 플레이트에서 설명되지 않은 알려지지 않은 항생제 또는 덜 일반적으로 발견된 항생제의 존재를 나타냅니다.
MARP고유의 성장 패턴은 야생형 E.coli BW25113과 하이퍼 투과성 및 e-플럭스 결핍 돌연변이 E.coli BW25113 bamB 톨C의 활용으로 인해 형성되었다. 이 결과는 그대로 외부 막을 능가할 수 없었던 항균 활성을 가진 화합물의 존재를 건의합니다. 이 대장균 성장 패턴은 고정 공구의 부적절하게 살균을 제안하며, 그 결과 오버레이를 통해 알려지지 않은 대장균 균주를 이송합니다.
그리고 ARP 또는 MARP 냉동 재고 라이브러리 플레이트 오염의 예는 직사각형 페트리 접시 표면에 재배 된 세 가지 뚜렷한 대장균 콜로니와 함께 여기에 도시된다. 이 결과는 복제 를 해제하는 동안 한천 오버레이가 관통되었다는 것을 나타냅니다. MHB 오버레이 관련 오염은 또한 복제 공정 중에 발생할 수 있으며, 오버레이 표면에 불규칙한 성장 패턴을 보여 주기도 한다.
이 프로토콜을 따르는 가장 중요한 것은 오염으로 인해 어떤 단계에서도 유지되지 않도록 적절한 살균 및 무균 기술을 사용하는 것입니다. 여기에는 MHB 오버레이를 부을 때 포자의 확산을 최소화하기 위해 베넷의 한천 판 표면에 가능한 한 가깝게 맞도록 니트로셀룰로오스 멤브레인을 준비하는 것이 포함됩니다. 또한 라이브러리 플레이트를 접종하고 복제를 해제하여 가장 깨끗한 결과를 생성할 때 제대로 살균된 고정 장비를 사용하는 것도 매우 중요합니다.
알려진 항생제를 복제하는 것 외에도,이 방법은 기존 항생제와 함께 사용할 수있는 보조제를 식별하는 데 적용 되어 활동을 구출할 수 있습니다. 항생제 비복제는 새로운 기술이 아니지만 자원 집약적이고 시간이 많이 걸리는 것으로 악명이 높습니다. ARP 및 MARP 플랫폼은 항생제 환복제가 대규모 생산이 될 필요가 없으며 최소 장비를 사용하여 2 주 동안 완료 할 수있는 방법에 대한 빛을 발산하는 데 도움이됩니다.
