我们的协议意义重大，因为它允许在不使用专用设备的情况下，对已知抗生素进行具有成本效益和及时的重复。此技术的主要优点是模板自定义。这意味着，个人可以根据所需的广泛或窄基质特异性水平，定制他们希望在库模板中包括哪些电阻基因。
例如，可以编写一个表示大肠杆菌模板的 beta-lactam，以便允许对β-乳酸及其各种子类进行高度特异性的重复。使用化粪池技术，移液器 500 微升的阳离子将 MHB 从无菌储液罐调整到无菌 96 深井板的每个井中。使用准备好的 ARP 或 MARP 应变板，使用施用器棒根据 ARP 或 MARP 图为 96 深井板接种。
将透气密封膜放在深井板表面，并在 37 摄氏度、250 RPM 下孵育过夜。确保没有受污染的油井。使用多通道移液器，将 100 微升从深井板的每个井转移到无菌的 96 井圆形底板。
在每个井中加入100微升无菌50%甘油，然后轻轻上下移液混合。至少准备五个库板。用无菌铝密封盖住板，并确保每口井都单独密封。
将板盖放在铝密封上，并在零下 80 摄氏度处存放。使用木制施用棒，轻轻地刮孢子从链球菌菌群的表面，并转移到一个试管，其中包含一个无菌玻璃珠和三毫升链球菌抗生素介质。用盖子松散地关闭试管，以便进行呼吸。
使用相同的木制施用棒，在含有贝内特的阿加的培养皿上条纹无菌控制。在30摄氏度下孵育含有种子培养的管子，在250 RPM时用气化6天，在30摄氏度下孵育无菌控制板，在30摄氏度下孵育6天。然后，在水平表面上，准备重复数据消除板。
将23毫升温暖的Bennett的气量吸入血清移液器中，并在长方形培养皿表面均匀地分配20毫升，将余下介质留在移液器中，以防止气泡的形成。用盖子盖住盘子。轻轻旋转板，直到介质覆盖板的所有区域，不要打扰它，直到搅拌完全设置。
接下来，使用矩形培养皿盖作为跟踪模板，准备硝基纤维素膜片，使片适合重复板的表面。切开床单，用无菌袋中密封。现在，检查无菌控制板，以确保在孵育六天后没有污染物存在。
如果无污染，请将矩形培养皿的盖子和移液器 200 微升的种子培养物取下到矩形培养皿中的 Bennett 的 agar 表面上。使用无菌棉签将培养能力均匀地分布到整个板的表面。要将准备好的硝基纤维素膜放在培养皿表面的培养物顶部，请将膜的下边缘与 Petri 盘的下边缘对齐，然后缓慢地将膜从下边缘涂抹到板的顶部边缘。
使用无菌棉签来平滑膜垫界面之间可能形成的任何气泡，确保膜与红质齐平。膜允许生物体在其表面孢子，而二次代谢物可能排泄到下面的介质中。将盖子放回长方形培养皿上，倒置在密封的塑料袋中。
在30摄氏度下孵育6天。六天后，从培养箱中取出重复物板。使用无菌钳子，小心地从贝内特的芳水表面去除硝基纤维素膜。
确保板边缘只有轻微的孢子生长，以减少污染要添加的覆盖物的机会。确保工作表面保持水平，并使用血清移液器吸气 23 毫升热阳离子调节的 MHB agar。通过均匀地在重复赖以板表面分配 20 毫升来创建覆盖层，将除法器中剩余的糖留在移液器中，以防止气泡的形成。
将盖子放在盘子上。轻轻旋转板，直到介质覆盖所有区域，不要打扰它，直到阿加完全设置。冷却和凝固后，将重复剂板返回密封的塑料袋，并在四摄氏度下倒置存放过夜，从而将二次代谢物扩散到 MHB agar 覆盖物中。
在同一天，通过首先将100微升的阳离子移液调整为96井板的每个井，为新的 ARP 或 MARP 模板接种。将冷冻库存 ARP 或 MARP 库板从零下 80 摄氏度的冰柜中取出。在冷凝开始在其底面形成之前，拆下铝密封。
使用无菌 96 孔固定工具，小心地从冷冻库存 ARP 或 MARP 库板固定，并接种含有 96 孔板的新鲜 MHB。为了最大限度地减少重复过程中受到的污染，请准备尽可能多的 ARP 或 MARP 库板，每个库板只需重复两到三个重复板。完成后，在冷冻模板上安装新的无菌铝密封，并返回到零下80摄氏度的冰柜。
将接种的 96 孔板放在松散密封的塑料袋内，在 37 摄氏度下孵育，在 250 RPM 下摇晃 18 小时。从培养箱中取出 ARP 或 MARP 模板，通过将板与 ARP 或 MARP 模板图进行比较，确保不存在任何污染物。从四摄氏度中去除重复数据消除板，并允许与室温平衡。
如果有冷凝，打开盖子，允许在无菌环境中干燥。使用无菌固定工具，从 ARP 或 MARP 库板固定到重复板的 MHB 加糖覆盖表面。小心不要刺穿阿加。
让模板孵化干燥三到五分钟。将接种的重复数据板倒置在密封的塑料袋中，在37摄氏度下孵育过夜。第二天，通过将重复数据消除板上的生长与对应于 ARP 或 MARP 图的井进行比较来分析重复结果。
在此 ARP 或 MARP 重复数据消除工作流中，实现了正重复结果。其中为WAC 8921菌株准备的提取物被确定为氯霉素生产商。ARP 生长的缺乏表明存在未知抗生素或不太常见的抗生素，该抗生素未计入 ARP 或 MARP 库板中。
MARP特有的生长模式形成，因为它同时使用野生型大肠杆菌BW25113和超渗透和电子通量缺乏大肠杆菌BW25113bBB tolC。这一结果表明，存在一种具有抗菌活性的化合物，这种化合物无法超越完整的外膜。这种大肠杆菌生长模式表明固定工具的灭菌不当，导致未知大肠杆菌菌株在覆盖物上转移。
此处显示了 ARP 或 MARP 冷冻库存库板污染的示例，其中三个不同的大肠杆菌菌落生长在矩形培养皿表面。结果表明，在重复过程中，加糖覆盖被刺穿。MHB 覆盖物相关的污染也可能在重复过程中发生，在覆盖物表面显示不规则的生长模式。
遵循此协议时，最重要的是使用适当的灭菌和无菌技术，以确保您不会因污染而在任何步骤中退缩。这包括制备硝基纤维素膜，使其尽可能与贝内特的芳脂板表面保持一致，以便在浇注 MHB 覆盖物时最大限度地减少孢子的扩散。此外，在接种库板和脱印时正确使用经过消毒的固定设备以产生最清洁的结果也非常重要。
除了脱印已知抗生素外，此方法还可用于识别可与现有抗生素结合使用的佐剂，以挽救其活性。虽然抗生素重复治疗不是一项新技术，但它因资源密集和耗时而臭名昭著。ARP 和 MARP 平台有助于揭示抗生素重复药物如何不需要是一个大型生产，而是可以使用最少的设备在两周内完成。
