Este protocolo es significativo, porque es la primera vez que los datos transcriptómicos en los mosquitos Anopheles Gambiae se hacen de libre y fácil acceso en un solo lugar. Esta técnica permite a todos los investigadores, incluso aquellos que no tienen antecedentes en bioinformática, acceder libre y fácilmente a los datos de expresión de sus genes favoritos y mosquitos resistentes a los insecticidas. Para comenzar, siga el enlace en la parte inferior de la página del proyecto LSTM IR-TEx para ejecutar la aplicación web IR-Tex en un navegador web.
Una vez que la página web se ha inicializado, haga clic en el botón Aplicación en la parte superior de la página, que mostrará la aplicación y las salidas asociadas. Lea cada salida relacionada con la entrada predeterminada en el cuadro de ID de transcripción. Condiciones selectas y conjuntos de datos Anopheles Coluzzii que están expuestos a insecticidas piretroides, o no expuestos a ninguna clase de insecticida y transcripciones asociadas con un coeficiente de correlación superior a 0,98.
Para explorar la expresión de una transcripción de interés, primero seleccione la transcripción. A continuación, introduzca el ID de transcripción en el cuadro de identificación de transcripción, recordando que las transcripciones terminan en RX dependiendo de la isoforma de interés. Seleccione los conjuntos de datos que se deben interrogar tomando las casillas correspondientes para los países, incluido el estado de exposición, las especies de interés y la clase de interés de insecticidas.
Asegúrese de que estos criterios dan como resultado más de un conjunto de datos incluido. Haga clic en Actualizar vista en la parte inferior del menú de selección o pulse Retorno, ignorando el valor de correlación absoluta por ahora. Conceda a la aplicación tiempo para actualizar.
Ya sea que el primer gráfico tenga el cambio de plegado De Log2 entre una población resistente, y una población de mosquitos susceptibles de laboratorio de la transcripción de interés, en cada conjunto de datos que cumpla con los criterios seleccionados. Lea la información debajo del gráfico como los cambios de plegado entre los mosquitos resistentes y susceptibles para cada conjunto de datos relevante, además de los valores P ajustados asociados. Cada fila representa sondeos individuales en la micro matriz.
Lea la tabla adicional a continuación, ya que el número de experimentos en los que la transcripción de interés es significativa, así como el número total de experimentos que coinciden con los criterios seleccionados. Para descargar los datos en formato separado por tabulaciones, haga clic en el botón Descargar debajo de las dos tablas. Esto permite al usuario explorar los datos de una manera más fácil, utilizando un programa como Excel.
Cada punto del mapa representa los sitios de recolección aproximada de mosquitos resistentes en cada conjunto de datos, en los que la transcripción de interés se expresa diferencialmente. Los colores siguen un sistema de semáforos que se explica en la aplicación. Guarde las salidas gráficas haciendo clic con el botón derecho, haciendo clic en Guardar imagen como y eligiendo una carpeta adecuada.
En el caso de un error de salida de la aplicación, es probable que ningún conjunto de datos coincida con los criterios introducidos. Las correlaciones de los patrones de expresión de las transcripciones en varios conjuntos de datos se pueden utilizar para predecir la función de transcripción y potencialmente dilucidar transcripciones coreguladas de la misma vía. Antes de hacer clic en Actualizar vista, mueva el control deslizante de valor de correlación absoluta a 0,85 y haga clic en Actualizar vista o pulse Retorno.
Examine la tabla de correlación para buscar las varias transcripciones que ahora se muestran y están correlacionadas con la entrada y la transcripción. Lea la tabla debajo de la salida gráfica, que contiene el valor de correlación para cada transcripción. Para descargar los datos en un formato separado por pestañas, haga clic en el botón Descargar.
Manipule el control deslizante del valor de correlación absoluta y observe cualquier cambio en la parte inferior de la tabla y el gráfico. Una menor rigurosidad del valor de correlación mostrará más transcripciones, pero introducirá más ruido. Una vez instalado el IR-TEx, abra RStudio Supplemental Coding File1 y ejecute cada línea para configurar el sistema para IR-TEx.
Una vez que todos los paquetes se hayan instalado y actualizado correctamente según sea necesario, vaya a Archivo, Abrir. Localice IR_TEx. r, resalte y abra.
Esto ahora debería ser visible en la ventana superior de RStudio. Para ejecutar la aplicación, presione el botón Ejecutar aplicación en la parte superior derecha de la ventana. Aparecerá una segunda ventana en la que se cargará la aplicación.
Una vez completada la carga, para obtener una funcionalidad completa, haga clic en Abrir en el navegador, situado en la parte superior derecha de la ventana cargada. El usuario puede agregar nuevos conjuntos de datos de resistencia a IR-TEx generados mediante la matriz Ansiheles Gambiae 15k Agilent, como se describe en el protocolo TEx. Abra Archivo adicional2.txt.
Este archivo de búsqueda de ARN representa la plantilla en la que se deben basar los nuevos datos. La columna A es identificador, la columna B es cambio de plegado sin procesar y la columna C se ajusta el valor P. Ejecute el código R para que coincida con los identificadores en un único archivo delimitado por tabulaciones entre plataformas y, a continuación, organice y normalice los datos.
Las instrucciones se encuentran en el archivo. Cualquier ruta de archivo se separará mediante una barra diagonal para Mac OS o una barra diagonal doble para Windows. Realice una copia de seguridad del archivo original.
Emita el archivo producido al final de Supplemental Coating File2 en una ubicación de elección para su uso en el siguiente paso. El archivo de codificación suplementario2 generará un nuevo Fold_Changes. Txt.
Ejecute el código contenido en Archivo de codificación suplementario3. Busque el archivo de salida denominado FC_DistribPlot. png en la carpeta especificada como ruta de acceso de archivo.
Compruebe las distribuciones de Log2 Fold Change para comprobar que las distribuciones de Log2 Fold Change son casi idénticas entre los conjuntos de datos. Aquí se muestra la expresión de ARNm de GS TMS1 y AGAP 009110 RA en dos poblaciones multirresistentes de Anopheles Coluzzii de Costa de Marfil y Burkina Faso, respectivamente. La comparación con el laboratorio susceptible Anopheles Coluzzii N-Guzo reveló que estas transcripciones están significativamente reguladas en dos poblaciones multirresistentes separadas.
Se realizó un derribo inducido por el ARN-I a mosquitos de la colonia T-Oscillae del laboratorio LSTM. Esta colonia es originaria de Costa de Marfil, y es resistente a todas las clases principales de insecticidas utilizados en la salud pública. La atenuación de la expresión de GS TMS1 dio lugar a un aumento significativo de la mortalidad, después de la exposición a Delta Matheran, en comparación con los controles inyectados por GFP, lo que demuestra la importancia de esta transcripción en la resistencia a los piretroides.
Por el contrario, AGAP 009110 RA derribó no resultó en ningún cambio significativo en la mortalidad después de la exposición. GST MS1 se expresó significativamente en 20 de los 21 conjuntos de datos de micro-array disponibles para estas especies. En cada ubicación, el Cambio de Pliegue fue significativamente mayor en los resistentes, en comparación con las poblaciones susceptibles.
Todos los conjuntos de datos son de diferentes experimentos a lo largo de numerosos años, y no fueron diseñados para un enfoque basado en microanálisis limpio, por lo que puede ser necesario reducir la rigurosidad normal del valor P. Más evaluación de derribo fenotípico se puede realizar con otros insecticidas, y rasgos de la historia de la vida. Si los resultados se ven lo suficientemente bien, la parasitización aguas abajo puede determinar el papel de la proteína.
Esta técnica es la primera aplicación para integrar datos transcriptómicos sobre la resistencia a los insecticidas del complejo de especies Anopheles Gambiae y ponerla a disposición de todos los investigadores en este campo.
