現在ヘテロクロマチン形成を促進する際に確立されている薬はありません。.ここでは、このプロセスを促進する低分子化合物を同定するための簡単で効率的な方法を提示する。当社のスクリーニングプロトコルは、ヘテロクロマチン促進薬物同定のための簡単で安価で、生体内システムに従いやすい。
ヘテロクロマチンの形成を促進する化合物を同定することは、治療やがん治療のメカニズムの発見につながる可能性があります。この費用対効果は、ショウジョウバエにおけるヘテロクロマチン促進化合物を同定するために測定されており、細胞スクリーニングの最高細胞プールに対する予防措置であるため、ヒットを数えるためにも使用できる。このショウジョウバエTranSheetシステムは、ハエに存在するヘテロクロマチンの量に反比例する多様な眼色表現型を生成するので、当社のスクリーニングプロトコルは、迅速なパイロットスクリーンにも有用である可能性があります。
手順のデモンストレーションを手伝うのは、私たちの研究室の学部生ケニー・ダオです。適切な溶媒を使用してスクリーニングのための薬物ライブラリーを同定し、準備した後、所望の濃度は、25×95ミリメートルの食物バイアルで3つ以上の処女雌ハエを持つ3つの雄のハエを渡る。標準的なショウジョウバエ食品培地の9ミリメートルで。
各薬剤に対して3つのレプリカバイアルを設定します。画面にコントロール バイアルを 1 つ追加します。そして、ハエが室温で2日間卵を産むことを許可します。
十字架の2日目に、二酸化炭素の短いバーストでハエを麻酔します。そして、70%エタノールを含むボトルに親のハエを捨てます。次に、初期ストックから各薬物化合物を希釈し、水中の33%DMSOでマイクロモル最終濃度に出席する。
そして、フライフードの上に、薬物の60マイクロリットル、またはコントロール33%DMSOを単独で加える。次に、バイアル内に親ハエが存在しないか確認します。そして、適切なバイアルに薬物溶液を追加します。
F1ハエが出現した2日後、一度に1つのバイアルから麻酔付きハエを濾過紙の下から二酸化炭素を濾過する多孔質解剖パッドに移す。解剖顕微鏡の下で、各ハエ全体を調べ、巻き毛のo-支配的な巻き毛の翼表現型の欠如によってヘテロ接合性の雄の全てを識別する。1から5のスケールで各ヘテロ接合男性の目の色をスコア。
1つのスコアが5%未満の赤散乱目総表面積に割り当てられていると。6〜25%の赤いスポットの目の総表面積を持つハエに2つのスコアを追加します。26〜50%の赤い斑点目の総表面積を持つ飛ぶ3。
4は51〜75%の赤い斑点目の総表面積を持つ飛ぶ。そして、75%以上の赤い斑点目の総表面積を持つ5つのハエ。次に、三重で採点された各バイアルからすべての男性の平均色指数を計算します。
化合物が実際にヘテロクロマチン形成を促進することを確認するために、ウェスタンブロッティングなどの異なる検証技術を、行うことができる。本代表的実験では、低分子薬物ライブラリーである腫瘍学セット3は、97のFDA認可腫瘍学薬で構成され、ショウジョウバエメラノガスターのDX1株を用いてスクリーニングした。スクリーニングアッセイによれば、メトトレキサートは、ライブラリー内でE7としてコード化され、Dx1株内で最も変動を引き起こした。
メトトレキサートが将来の癌標的治療のための最も有望なヘテロクロマチン促進薬である可能性を示唆する。この化合物がヘテロクロマチン変換を促進することを更に確認するために、ウェスタンブロットデータが行われた。ヘテロクロマチン関連タンパク質のアップ調節を実証し、H3K9トリメチル化、スクリーニング結果を検証した。
重要なステップは、所定の研究ルートに従って1〜5のスケールで白い11-18 DX1ヘテロ接合オスのハエのそれぞれの目の色を採点することです。ウエスタンブロットまたは免疫染色を使用してヒットを確認できます。ヘテロクロマチンの形成を促進すると疑われる化合物の発見は、ヒト患者におけるがんの発症と臨床試験のIV遺伝的メカニズムの発見にもつながる可能性がある。
