Derzeit gibt es keine Medikamente, die bei der Förderung der Heterochromatin-Bildung gut etabliert sind. Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode zur Identifizierung kleiner Molekülverbindungen, die diesen Prozess fördern. Unser Screening-Protokoll bietet ein einfaches, kostengünstiges, leicht zu verfolgendes In-vivo-System zur Heterochromatin-fördernden Arzneimittelidentifikation.
Die Identifizierung von Verbindungen, die die Heterochromatinbildung fördern, kann zur Entdeckung von Mechanismen von Krebs führen, die sich vermändern und Krebstherapie. Diese kostengünstige wurde für die Identifizierung von Heterochromatin fördernden Verbindungen in Drosophila gemessen könnte auch verwendet werden, um FormTreffer zu zählen, da es eine vorbeugende Maßnahme zu einem höchsten Zellpool von Zellscreening ist. Unser Screening-Protokoll könnte auch für schnelle Pilotbildschirme nützlich sein, da dieses Drosophila TranSheet-System einen bunten Augenfarbphänotyp erzeugt, der umgekehrt mit der Menge an Heterochromatin korreliert, die in der Fliege vorhanden ist.
Mit dabei, das Verfahren zu demonstrieren, wird Kenny Dao helfen, ein Student aus unserem Labor. Nach der Identifizierung und Vorbereitung einer Arzneimittelbibliothek für ein Screening mit einem geeigneten Lösungsmittel und der gewünschten Konzentration kreuzen Sie drei männliche Fliegen mit drei oder mehr jungfräulichen weiblichen Fliegen in einer 25 mal 95 Millimeter großen Lebensmittelflasche. Mit neun Millimetern Standard-Drosophila-Lebensmittelmedium.
Richten Sie drei Replik-Fläschchen für jedes Medikament ein. Fügen Sie eine Durchstechflasche für den Bildschirm hinzu. Und lassen Sie die Fliegen Eier für zwei Tage bei Raumtemperatur legen.
Am zweiten Tag des Kreuzes, beästhesieren Sie die Fliegen mit einem kurzen Ausbruch von Kohlendioxid. Und entsorgen Sie die Elternfliegen in einer Flasche mit 70% Ethanol. Als nächstes verdünnen Sie jede Wirkstoffverbindung aus dem Ausgangsbestand, um die mikromolare Endkonzentration in 33% DMSO in Wasser zu erreichen.
Und fügen Sie 60 Mikroliter des Medikaments, oder die Kontrolle 33%DMSO allein, auf die Fliege Lebensmittel. Bestätigen Sie dann, dass keine Elternfliegen innerhalb der Durchstechflaschen vorhanden sind. Und fügen Sie die Arzneimittellösung zu den entsprechenden Fläschchen hinzu.
Zwei Tage nach dem Auftauchen der F1-Fliegen übertragen Sie anästhesierte Fliegen von einer Durchstechflasche nach der anderen auf ein poröses Sezieren, wobei Kohlendioxid unter dem Filterpapier durchfiltriert wird. Unter einem Sezieren mikroskop, untersuchen Sie jede ganze Fliege, identifizieren alle heterozygotmännchen Männchen durch ihr Fehlen der lockigen o-dominanten lockigen Flügel Phänotyp. Erzielen Sie die Augenfarbe jedes heterozygoten Männchens auf einer Skala von eins bis fünf.
Mit einer Punktzahl, die einer Gesamtfläche von weniger als 5% rot verstreuten Augen zugewiesen wird. Fügen Sie zwei Punkte zu Fliegen mit einer Gesamtfläche des roten Fleckauges von 6 bis 25 % hinzu. Eine Drei-zu-Fliegen mit einer Gesamtfläche von 26 bis 50% rotem Fleckauge.
Eine Vier-zu-Fliegen mit einer Gesamtfläche von 51 bis 75% rotem Fleckauge. Und eine Fünf fliegt mit einer Gesamtfläche von mehr als 75% rotem Fleckauge. Dann berechnen Sie den mittleren Farbindex aller Männchen aus jeder Durchstechflasche in Dreifache bewertet.
Um zu bestätigen, dass die Verbindungen tatsächlich die Heterochromatinbildung fördern, kann eine andere Validierungstechnik, wie z. B. Western Blotting, durchgeführt werden. In diesem repräsentativen Experiment wurde eine kleine Molekül-Arzneimittelbibliothek, Onkologie-Set 3, die aus 97 FDA-zugelassenen Onkologie-Medikamenten besteht, mit dem DX1-Stamm von Drosophila Melanogaster untersucht. Laut Screening-Test verursachte Methotrexat, in der Bibliothek als E7 kodiert, die meisten Variationen innerhalb des Dx1-Stamms.
Der Vorschlag, dass Methotrexat das vielversprechendste Heterochromatin-fördernde Medikament für zukünftige krebsgezielte Therapie sein könnte. Um weiter zu bestätigen, dass diese Verbindung die Heterochromatin-Transformation fördert, wurden westliche Blot-Daten durchgeführt. Nachweis der Bisregulation des Heterochromatin-Formats im assoziierten Protein, H3K9-Trimethylierung, und Validierung der Screening-Ergebnisse.
Der entscheidende Schritt ist die Bewertung der Augenfarbe jeder der weißen 11-18 DX1 heterozygoten männlichen Fliegen auf einer Skala von eins bis fünf nach einer vorgegebenen Studienroute. Wir können westliche Flecken oder Immunostaining verwenden, um die Treffer zu bestätigen. Die Entdeckung von Verbindungen, die im Verdacht stehen, die Heterochromatinbildung zu fördern, kann auch zur Entdeckung des IV-Genetischen Mechanismus der Krebsentwicklung und klinischer Studien bei menschlichen Patienten führen.
