Şu anda heterokromatin oluşumunu teşvik iyi kurulmuş hiçbir ilaç vardır. Burada bu süreci teşvik küçük molekül bileşikleri tanımlamak için basit ve verimli bir yöntem salıyoruz. Tarama protokolümüz heterokromatin teşvik edici ilaç tanımlaması için in vivo sistemi takip edilmesi kolay, basit, ucuz ve kolay bir sistem sağlar.
Heterokromatin oluşumunu teşvik bileşiklerin belirlenmesi, onarıyor ve kanser tedavisi kanser mekanizmalarının keşfine yol açabilir. Bu maliyet etkin Drosophila heterokromatin teşvik bileşikleri tanımlamak için ölçüldü de hücre tarama en yüksek hücre havuzu için önleyici bir önlem olarak form isabet saymak için kullanılabilir. Bu Drosophila TranSheet sistemi sineğe mevcut heterokromatin miktarı ile ters orantılı bir alacalı göz rengi fenotip üretir gibi bizim tarama protokolü de hızlı pilot ekranlar için yararlı olabilir.
Prosedürü niçin göstermek için Yardım Kenny Dao, bizim laboratuvar dan bir lisans öğrencisi olacaktır. Uygun bir çözücü kullanarak bir tarama için bir ilaç kütüphanesi tanımladıktan ve hazırladıktan sonra, ve istenilen konsantrasyon, üç erkek sinekler çapraz üç veya daha fazla bakire kadın sinekler bir 25 tarafından 95 milimetrelik gıda şişesi. Standart Drosophila gıda ortamı dokuz milimetre ile.
Her ilaç için üç tane kopya şişe ayarlayın. Ekran için bir kontrol şişesi ekleyin. Ve sineklerin oda sıcaklığında iki gün boyunca yumurtlamalarına izin verin.
Haçın ikinci gününde, sinekleri kısa bir karbondioksit patlamasıyla anestezi edin. Ve% 70 etanol içeren bir şişe içinde ebeveyn sinekatın. Daha sonra, ilk stoktan her ilaç bileşiğini seyreltin ve suda %33 DMSO'daki mikro molar son konsantrasyonuna katılın.
Ve 60 mikrolitre ilacın ekleyin, ya da kontrol 33% DMSO tek başına, sinek gıda üstüne. O zaman şişelerde ebeveyn sineklerinin bulunmadığını doğrulayın. Ve ilaç çözeltisini uygun şişelere ekleyin.
F1 sinekleri ortaya çıktıktan iki gün sonra, anestezik sinekleri bir şişeden filtre kağıdının altından süzülen karbondioksit içeren gözenekli bir diseksiyon yastığına aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, her bir sinek incelemek, kıvırcık o-baskın kıvırcık kanat fenotipi eksikliği ile heterozigot erkeklerin tüm tespit. Puan her heterozigot erkek göz rengi bir ile beş arasında bir ölçekte.
Bir puan ile daha az% 5 kırmızı dağınık göz toplam yüzey alanına atanmaktadır. %6-25 kırmızı nokta göz toplam yüzey alanı ile sinekler için iki puan ekleyin. %26-50 kırmızı nokta göz toplam yüzey alanı ile sinekler için bir üç.
%51-75 kırmızı nokta göz toplam yüzey alanı ile uçar dört. Ve beş sinek %75'ten daha büyük kırmızı nokta göz toplam yüzey alanı ile. Sonra triplicate puan her şişe tüm erkeklerin ortalama renk indeksi hesaplayın.
Bileşiklergerçekten heterokromatin oluşumuteşvik onaylamak için, farklı bir doğrulama tekniği, batı lekeleme gibi, yapılabilir. Bu temsili deneyde, 97 FDA yetkili onkoloji ilaçlarından oluşan onkoloji seti 3 olan küçük moleküllü ilaç kütüphanesi Drosophila Melanogaster'in DX1 suşkullanılarak tarandı. Tarama tadına göre, kütüphanede E7 olarak kodlanan metotreksat, Dx1 suşu içinde en fazla varyasyona neden oldu.
Metotreksat gelecekteki kanser hedefli tedavi için en umut verici heterokromatin teşvik ilaç olabileceğini düşündüren. Bu bileşiğin heterokromatin dönüşümlerini desteklediğini doğrulamak için batı leke verileri gerçekleştirildi. Ilişkili protein, H3K9 trimilasyon heterokromatin formatının yukarı düzenleme gösteren ve tarama sonuçları doğrulanması.
Kritik adım, önceden belirlenmiş bir çalışma rotasına göre 1-5 arasında bir ölçekte beyaz 11-18 DX1 heterozigot erkek sineklerin her birinin göz rengini puanlamadır. Darbeleri doğrulamak için batı lekelerini ya da immünboymayı kullanabiliriz. Heterokromatin oluşumunu teşvik ettiğinden şüphelenilen bileşiklerin keşfi, insan hastalarında kanser gelişiminin IV genetik mekanizmasının ve klinik çalışmaların keşfine de yol açabilir.
