В настоящее время нет препаратов, которые хорошо зарекомендовали себя в содействии формированию гетерохроматина. Здесь мы представляем простой и эффективный метод выявления небольших молекул соединений, которые способствуют этому процессу. Наш протокол скрининга обеспечивает простую, недорогую, простую в использовании систему in vivo для идентификации наркотиков, пропагандирующих гетерохроматин.
Выявление соединений, которые способствуют формированию гетерохроматина может привести к открытию механизмов рака, что починка и терапии рака. Эта экономически эффективная была измерена для выявления гетерохроматина поощрения соединений в Drosophila также может быть использован для подсчета формы хитов, как это превентивная мера для самого высокого клеточного пула клеточного скрининга. Наш протокол скрининга также может быть полезен для быстрых пилотных экранов, так как эта система Drosophila TranSheet производит пестрый фенотип цвета глаз, который обратно коррелирует с количеством гетерохроматина, присутствуют на лету.
Помочь продемонстрировать процедуру будет Кенни Дао, студент-студент из нашей лаборатории. После выявления и подготовки библиотеки наркотиков для скрининга с использованием соответствующего растворителя, и желаемой концентрации, крест трех самцов мух с тремя или более девственными самками мух в 25 на 95 миллиметров пищевой флакон. С девятью миллиметрами стандартной дрозофилы пищевой среды.
Настройка трех реплик флаконов для каждого препарата. Добавьте один контрольный флакон для экрана. И позволить мухам откладывать яйца в течение двух дней при комнатной температуре.
На второй день креста, анестезировать мух с коротким взрывом углекислого газа. И отбросить родителей летит в бутылке, содержащей 70% этанола. Далее разбавляют каждое лекарственное соединение из первоначального запаса для участия в микро-молярной конечной концентрации в 33%DMSO в воде.
И добавить 60 микролитров препарата, или контроль 33%DMSO только, на вершине мухи пищи. Затем подтвердите, что в флаконах нет родительских мух. И добавьте раствор препарата в соответствующие флаконы.
Через два дня после появления мух F1, передача анестезированных мух из одного флакона в то время, на пористой вскрытой площадке с углекислым газом фильтрации через из-под фильтровальной бумаги. Под рассечением микроскопа, изучить каждую всю муху, выявление всех гетерозиготных самцов по их отсутствию кудрявый о-доминирующей фигурные фенотип крыла. Оценка цвета глаз каждого гетерозиготного самца по шкале от одного до пяти.
С одной оценкой присваивается менее 5%красный рассеянный глаз общей площади поверхности. Добавить два балла мух с 6 до 25%красное пятно глаз общей площади поверхности. Три мухи с 26 до 50%красное пятно глаз общей площади поверхности.
Четыре мухи с 51 до 75%красное пятно глаз общей площади поверхности. И пять мух с более чем 75%красное пятно глаз общей площади поверхности. Затем вычислите средний цветовой индекс всех самцов с каждого флакона, забитого в трипликате.
Чтобы подтвердить, что соединения действительно способствуют формированию хетерохроматина, можно выдать другой метод проверки, такой как западный blotting. В этом репрезентативном эксперименте, небольшая библиотека молекулы наркотиков, онкология набор 3, который состоит из 97 FDA уполномоченных онкологических препаратов, был проверен с помощью штамма DX1 Drosophila Меланогастер. Согласно скрининговому анализу, метотрексат, закодированный как E7 в библиотеке, вызвал наибольшее изменение штамма Dx1.
Предполагая, что метотрексат может быть наиболее перспективным гетерохроматин содействия препарат для будущей терапии рака целевых. Для дальнейшего подтверждения того, что это соединение способствует трансформации гетерохроматина, западные данные пятно было выполнено. Демонстрация регуляции гетерохроматина форматина связанного белка, триметилирования H3K9 и проверки результатов скрининга.
Критическим шагом является оценка цвета глаз каждого из белых 11-18 DX1 гетерозиготных самцов мух по шкале от одного до пяти в соответствии с предопределенным маршрутом исследования. Мы можем использовать западные помарки или иммуностимуляторы для подтверждения попаданий. Открытие соединений, которые, как предполагается, способствуют формированию гетерохроматина, также может привести к открытию IV генетического механизма развития рака и клинических испытаний у пациентов.
