Attualmente non ci sono farmaci che sono ben consolidati nel promuovere la formazione di eterocromatina. Qui presentiamo un metodo semplice ed efficiente per identificare i composti di piccole molecole che promuovono questo processo. Il nostro protocollo di screening fornisce un sistema in vivo semplice, economico e facile da seguire per l'identificazione dei farmaci che promuovono l'eterocromatina.
L'identificazione di composti che promuovono la formazione di eterocromatina può portare alla scoperta di meccanismi di cancro che riparano e terapia del cancro. Questo costo efficace è stato misurato per identificare composti che promuovono l'eterocromatina in Drosophila potrebbe anche essere usato per contare i colpi di forma in quanto è una misura preventiva per un pool di cellule più alto di screening cellulare. Il nostro protocollo di screening potrebbe anche essere utile per schermi pilota veloci in quanto questo sistema Drosophila TranSheet produce un fenotipo variegato del colore degli occhi che è inversamente correlato alla quantità di eterocromatina presente al volo.
Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà Kenny Dao, uno studente universitario del nostro laboratorio. Dopo aver identificato e preparato una libreria di farmaci per uno screening utilizzando un solvente appropriato e la concentrazione desiderata, attraversare tre mosche maschili con tre o più mosche femminili vergini in una fiala alimentare da 25 per 95 millimetri. Con nove millimetri di mezzo alimentare standard Drosophila.
Impostare tre flaconcini replica per ogni farmaco. Aggiungere una fiala di controllo per lo schermo. E consentire alle mosche di deporre le uova per due giorni a temperatura ambiente.
Il secondo giorno della croce, anestetizza le mosche con una breve esplosione di anidride carbonica. E scartare le mosche dei genitori in una bottiglia contenente il 70% di etanolo. Successivamente, diluire ogni composto farmacologico dallo stock iniziale per partecipare alla concentrazione finale di micro molare nel 33% di DMSO in acqua.
E aggiungere 60 microlitri del farmaco, o il controllo 33%DMSO da solo, sopra il fly food. Quindi conferma che nessuna mosca genitore è presente all'interno delle fiale. E aggiungi la soluzione farmacologica alle fiale appropriate.
Due giorni dopo l'emergere delle mosche di F1, trasferire le mosche anestetizzate da una fiala alla volta su un cuscinetto di sezionamento poroso con anidride carbonica che filtra da sotto la carta filtrante. Al microscopio sezionato, esaminare ogni mosca intera, identificando tutti i maschi eterozigoti per la loro mancanza del fenotipo riccio o-dominante delle ali riccie. Segna il colore degli occhi di ogni maschio eterozigote su una scala da uno a cinque.
Con un punteggio assegnato a una superficie totale degli occhi sparsi inferiore al 5%. Aggiungi un punteggio di due alle mosche con una superficie totale degli occhi da 6 a 25%. Un tre per volare con una superficie totale degli occhi macchiati dal 26 al 50%.
Un quattro per volare con una superficie totale degli occhi macchiati dal 51 al 75%. E un cinque vola con una superficie totale degli occhi a macchia rossa superiore al 75%. Quindi calcola l'indice di colore medio di tutti i maschi da ogni flaconcino segnato in triplice copia.
Per confermare che i composti promuovono effettivamente la formazione di eterocromatina, è possibile eseguire una tecnica di convalida diversa, come l'assorbimento occidentale. In questo esperimento rappresentativo, una libreria di farmaci a piccole molecole, l'oncologia set 3, che è composta da 97 farmaci oncologici autorizzati dalla FDA, è stata schermata usando il ceppo DX1 di Drosophila Melanogaster. Secondo il saggio di screening, il metotrexato, codificato come E7 in libreria, ha causato la maggior variazione all'interno del ceppo Dx1.
Suggerendo che il metotrexato potrebbe essere il farmaco più promettente per la promozione dell'eterocromatina per la futura terapia mirata al cancro. Per confermare ulteriormente che questo composto promuove la trasformazione dell'eterocromatina, sono stati eseguiti dati western blot. Dimostrare la regolazione up del formato eterocromatina nella proteina associata, trietilazione H3K9 e convalidare i risultati dello screening.
Il passo critico è segnare il colore degli occhi di ciascuna delle mosche eterozigoti bianche 11-18 DX1 su una scala da uno a cinque secondo una via di studio predeterminata. Possiamo usare macchie occidentali o immunosottenimenti per confermare i colpi. La scoperta di composti che si sospetta promuovano la formazione di eterocromatina può anche portare alla scoperta del meccanismo genetico IV dello sviluppo del cancro e degli studi clinici in pazienti umani.
