Atualmente não existem drogas bem estabelecidas na promoção da formação de heterocromatina. Aqui apresentamos um método simples e eficiente para identificar pequenos compostos de moléculas que promovem esse processo. Nosso protocolo de triagem fornece um sistema in vivo simples, barato e fácil de seguir para identificação de medicamentos que promove a heterocromatina.
Identificar compostos que promovem a formação da heterocromatina pode levar à descoberta de mecanismos de câncer que consertam e terapia contra o câncer. Este custo-benefício foi medido para identificar compostos promotores de heterocromatina em Drosophila também poderia ser usado para contar golpes de forma, pois é uma medida preventiva para uma maior piscina celular de triagem celular. Nosso protocolo de triagem também pode ser útil para telas piloto rápidas, pois este sistema Drosophila TranSheet produz um fenótipo de cor dos olhos variegated que está inversamente correlacionado com a quantidade de heterocromatina presente na mosca.
Ajudando a demonstrar o procedimento será Kenny Dao, um estudante de graduação do nosso laboratório. Depois de identificar e preparar uma biblioteca de drogas para uma triagem usando um solvente apropriado, e a concentração desejada, cruze três moscas machos com três ou mais moscas fêmeas virgens em um frasco de comida de 25 por 95 milímetros. Com nove milímetros de média alimentar Drosophila padrão.
Configure três frascos de réplica para cada droga. Adicione um frasco de controle para a tela. E permitir que as moscas coloquem ovos por dois dias em temperatura ambiente.
No segundo dia da cruz, anestesiar as moscas com uma pequena explosão de dióxido de carbono. E descarte as moscas dos pais em uma garrafa contendo 70% de etanol. Em seguida, diluir cada composto de droga do estoque inicial para atender à concentração final do micro molar em 33% DMSO na água.
E adicione 60 microliters da droga, ou o controle 33% DMSO sozinho, em cima da comida de mosca. Então confirme que nenhuma mosca dos pais está presente dentro dos frascos. E adicione a solução de droga aos frascos apropriados.
Dois dias após as moscas da F1 emergirem, transfira moscas anestesiadas de um frasco de cada vez para uma almofada de dissecação porosa com filtragem de dióxido de carbono por baixo do papel filtro. Sob um microscópio dissecando, examine cada mosca inteira, identificando todos os machos heterozigos pela falta do fenótipo de asa encaracolada e encaracolada. Marque a cor dos olhos de cada macho heterozigo em uma escala de um a cinco.
Com uma pontuação única sendo atribuída a uma área de superfície total de olho disperso inferior a 5%. Adicione uma pontuação de dois para moscas com uma área de superfície total de olho de 6 a 25% de mancha vermelha. Um três para voar com uma área de superfície total de olho de 26 a 50% de manchas vermelhas.
Um quatro para voar com uma área de superfície total de olho de 51 a 75% de mancha vermelha. E um cinco moscas com uma área de superfície total de olho de 75% vermelha. Em seguida, calcule o índice médio de cor de todos os machos de cada frasco pontuado em triplicado.
Para confirmar que os compostos realmente promovem a formação de heterocromatina, uma técnica de validação diferente, como a mancha ocidental, pode ser realizada. Neste experimento representativo, uma pequena biblioteca de medicamentos de moléculas, o conjunto oncológico 3, que é composto por 97 medicamentos de oncologia autorizados pela FDA, foi examinado usando a cepa DX1 de Drosophila Melanogaster. De acordo com o ensaio de triagem, o metotrexato, codificado como E7 na biblioteca, causou a maior variação dentro da cepa Dx1.
Sugerindo que o metotrexato pode ser o medicamento mais promissor para a heterocromatina para futura terapia direcionada ao câncer. Para confirmar ainda mais que este composto promove a transformação da heterocromatina, foram realizados dados de manchas ocidentais. Demonstrando a regulação da heterocromatina formatina associada à proteína, trimetilação H3K9 e validação dos resultados de triagem.
O passo crítico é marcar a cor dos olhos de cada um dos 11-18 DX1 heterozigos machos brancos em uma escala de um a cinco, de acordo com uma rota de estudo predeterminada. Podemos usar manchas ocidentais ou imunossagens para confirmar os golpes. A descoberta de compostos suspeitos de promover a formação de heterocromatina também pode levar à descoberta de mecanismo genético IV de desenvolvimento do câncer e ensaios clínicos em pacientes humanos.
