Nuestro protocolo aborda una necesidad insatisfecha de un método robusto y reproducible para el análisis cuantitativo de los cambios articulares en el desarrollo y progresión de la osteoartritis. Nuestra técnica describe parámetros específicos y reproducibles para el análisis cuantitativo de cambios en múltiples tejidos articulares en la osteoartritis. Como esta técnica permite el análisis cuantitativo de la osteoartritis, se puede emplear para comparar los efectos de tratamientos específicos en múltiples tejidos articulares con el fin de evaluar su eficacia terapéutica.
Nuestro protocolo también se puede aplicar a otros modelos de osteoartritis o áreas de investigación musculoesquelética en las que se necesita cuantificación del cartílago y el hueso. Aunque el sistema es sencillo e intuitivo, las sesiones de entrenamiento siguen siendo necesarias para practicar la obtención de mediciones de forma repetida para lograr la reproducibilidad. Vengadeshprabhu Karuppagounder, un erudito postdoctoral de nuestro laboratorio, ahora demostrará nuestro procedimiento.
Comience encendiendo el microscopio, la cámara, el ordenador y el monitor de pantalla táctil. Seleccione el objetivo 4X y haga clic en el icono de software para iniciar el programa de software. Coloque la diapositiva en la etapa del microscopio y centre la muestra dentro de la ventana de medición asegurándose de que la cuadrícula de medición se establece en el aumento adecuado para que coincida con el objetivo en que tanto la superficie articular tibial y femoral como el hueso subcondral tibial se incluyen dentro de las regiones de imagen de interés.
A continuación, en el menú Archivo, seleccione Configuración de lectura. En la ventana Configuración, seleccione el archivo de configuración adecuado para los parámetros que se van a medir. Para medir el área total del cartílago, seleccione la función Tib TC y trace a lo largo del borde superior de la superficie del cartílago tibial donde el cartílago se encuentra con el espacio articular y a lo largo de la unión condro-osseous donde el cartílago calcificado se encuentra con el hueso subcondral.
Para medir el área del cartílago calcificado, seleccione la función Tib CC y trace una línea a lo largo de la marca de la marea, una línea natural que separa las regiones calcificadas y no álficas del cartílago, y a lo largo de la unión condroo-ossea donde el cartílago calcificado se encuentra con el hueso subcondral. Para determinar el área del cartílago no escalificado, reste el área del cartílago calcificado del área total del cartílago. Para determinar el número de condrocitos, cree funciones de recuento independientes dentro de los ajustes del software de histomorometría para distinguir los condrocitos productores de matrices y no productores.
A continuación, utilice el lápiz para hacer un pequeño punto sobre cada condrocitos expresando el fenotipo especificado para determinar el número de matrices que producen o no producen condrocitos. Para medir el parámetro de superficie articular tibial total, trace una línea a través de la superficie del cartílago tibial para definir cuidadosamente las fibrilaciones individuales. A continuación, dibuje una segunda línea a lo largo de la marca de marea para que sirva como control interno para el plano de cada sección y divida el parámetro de superficie articular tibial por el parámetro de marca de marea para calcular el índice de fibrilación de superficie articular tibial.
Para medir el área de espacio de la médula subcondral, seleccione la función Area de médula. A continuación, dibuje líneas alrededor del parámetro de estas áreas para determinar el área total del espacio de la médula ósea dentro del hueso subcondral tibial. Para medir el área subcondral total, seleccione la función Hueso Subcondral y delinee la región entre la unión condro-osseous en el borde superior de la placa de crecimiento que se extiende lateralmente a las regiones de los osteofitos anterior y posterior.
A continuación, reste el área del espacio de la médula ósea subcondral del área subcondral total para calcular el área ósea subcondral. Para medir el área osteofíla, seleccione la función de osteofito anterior y trace el osteofito anterior de la tibia proximal. A continuación, seleccione el osteofito posterior y trace el osteofito posterior de la tibia proximal.
Para medir el grosor de la sinovial femoral anterior, haga clic en Anterior Femur Synovium Meniscus y dibuje una línea desde el punto de inserción interno del sinovium anterior en el fémur hacia su punto de unión en el menisco y una línea desde la inserción externa del sinovium en el fémur hacia su fijación al menisco. A continuación, divida el área sinovial total por el parámetro sinovial para calcular el grosor sinovial. La osteoartritis inducida por DMM resulta en un aumento de la puntuación de La Sociedad de Investigación de Osteoartritis en comparación con ratones falsos.
Claramente caracterizado por la erosión de la superficie y la pérdida de cartílago. Este protocolo de histomormetría se puede utilizar para detectar varios cambios asociados a la osteoartritis, incluyendo una disminución en el cartílago total y áreas de cartílago nocalcificado. Una reducción en el número total de condrocitos y, lo que es más importante, una pérdida en el número de matriz que produce condrocitos.
También se observan cambios en la superficie articular, indicativos de la gravedad de la erosión, incluyendo un aumento general en el índice de fibrilación. La osteoartritis también incluye un aumento en el área ósea subcondral y una reducción en el área del espacio de la médula ósea en ratones DMM que indican esclerosis ósea subcondral. Tanto las áreas de osteofito anterior y posterior también aumentaron en ratones DMM, lo que sugiere una remodelación ósea subcondral en curso que actúa como un mecanismo compensatorio para manejar los cambios en la carga de las articulaciones en el sitio de la lesión.
El análisis histomorfométrico del sinovium muestra un aumento en el grosor sinovial en ratones DMM. Un resultado típico de la osteoartritis asociada a la inflamación sinovial y la difusión de citoquinas inflamatorias en el espacio articular. Además, no se observa ninguna variabilidad entre usuarios significativa entre el análisis histomorfométrico del área de cartílago nocalcificado en la puntuación de Osteoarthritis Research Society International.
Después del análisis histomorfométrico, se pueden utilizar diapositivas secuenciales y tinción de inmunofluorescencia para examinar los cambios en la expresión de proteínas entre las muestras.
