Il nostro protocollo affronta la necessità insoddisfatta di un metodo robusto e riproducibile per l'analisi quantitativa dei cambiamenti articolari nello sviluppo e nella progressione dell'osteoartrite. La nostra tecnica delinea parametri specifici e riproducibili per l'analisi quantitativa dei cambiamenti nei tessuti articolari multipli nell'osteoartrite. Poiché questa tecnica consente l'analisi quantitativa dell'osteoartrite, può essere utilizzata per confrontare gli effetti di trattamenti specifici su più tessuti articolari al fine di valutarne l'efficacia terapeutica.
Il nostro protocollo può essere applicato anche ad altri modelli di osteoartrite o aree di ricerca muscoloscheletricha in cui è necessaria la quantificazione della cartilagine e dell'osso. Sebbene il sistema sia semplice e intuitivo, le sessioni di allenamento sono ancora necessarie per esercitarsi a ottenere misurazioni in modo ripetuto per ottenere la riproducibilità. Vengadeshprabhu Karuppagounder, uno studioso post-dottorato del nostro laboratorio, ora dimostrazionerà la nostra procedura.
Inizia accendendo il microscopio, la fotocamera, il computer e il monitor touch screen. Selezionare l'obiettivo 4X e fare clic sull'icona del software per avviare il programma software. Posizionare la diapositiva sullo stadio del microscopio e centrare il campione all'interno della finestra di misurazione assicurando che la griglia di misurazione sia impostata sull'ingrandimento corretto per corrispondere all'obiettivo in quanto sia la superficie articolare tibiale che quella femorale e l'osso subcondrale tibiale sono inclusi nelle regioni di immagine di interesse.
Quindi, nel menu File, selezionare Leggi impostazioni. Nella finestra Impostazioni selezionare il file di impostazioni appropriato per i parametri da misurare. Per misurare l'area totale della cartilagine, selezionare la funzione Tib TC e tracciare lungo il bordo superiore della superficie della cartilagine tibiale dove la cartilagine incontra lo spazio articolare e lungo la giunzione condro-ossea dove la cartilagine calcificata incontra l'osso subcondrale.
Per misurare l'area della cartilagine calcificata selezionare la funzione Tib CC e tracciare una linea lungo il segno di marea, una linea naturale che separa le regioni calcificate e non calcificate della cartilagine, e lungo la giunzione condro-ossea dove la cartilagine calcificata incontra l'osso subcondrale. Per determinare l'area della cartilagine non calcolata, sottrarre l'area della cartilagine calcificata dall'area totale della cartilagine. Per determinare il numero di condrociti, creare funzioni di conteggio separate all'interno delle impostazioni nel software di istomorfometria per distinguere i condrociti che producono matrici e matrici non producono.
Quindi utilizzare lo stilo per creare un piccolo punto su ogni condrocita esprimendo il fenotipo specificato per determinare il numero di matrici che producono o non producono condrociti. Per misurare il parametro totale della superficie articolare tibiale, tracciate una linea sulla superficie della cartilagine tibiale per definire attentamente le singole fibrillazioni. Quindi disegnare una seconda linea lungo il segno di marea per fungere da controllo interno per il piano di ogni sezione e dividere il parametro della superficie articolare tibiale per il parametro del segno di marea per calcolare l'indice di fibrillazione della superficie articolare tibiale.
Per misurare l'area dello spazio del midollo subcondrale, selezionare la funzione Area midollo. Quindi disegnare linee attorno al parametro di queste aree per determinare l'area totale dello spazio del midollo osseo all'interno dell'osso subcondrale tibiale. Per misurare l'area subcondrale totale, selezionare la funzione Osso subcondrale e delineare la regione tra la giunzione condro-ossea nel bordo superiore della piastra di crescita che si estende lateralmente alle regioni degli osteofiti anteriore e posteriore.
Quindi sottrarre l'area del midollo osseo subcondrale dall'area subcondrale totale per calcolare l'area ossea subcondrale. Per misurare l'area dell'osteofita, selezionare la funzione osteofita anteriore e tracciare l'osteofita anteriore della tibia prossimale. Quindi selezionare l'osteofita posteriore e rintracciare l'osteofita posteriore della tibia prossimale.
Per misurare lo spessore sinoviale femorale anteriore, fare clic su Anterior Femur Synovium Meniscus e disegnare una linea dal punto di inserimento interno del sinovio anteriore sul femore verso il suo punto di attacco sul menisco e una linea dall'inserimento esterno del sinovio sul femore verso il suo attaccamento al menisco. Quindi dividere l'area sinoviale totale per il parametro sinoviale per calcolare lo spessore sinoviale. L'osteoartrite indotta da DMM si traduce in un aumento del punteggio Osteoarthritis Research Society International rispetto ai topi finti.
Distintamente caratterizzato dall'erosione superficiale e dalla cartilagine persa. Questo protocollo istomorfometrico può essere utilizzato per rilevare diversi cambiamenti associati all'osteoartrite, tra cui una diminuzione della cartilagine totale e aree cartilaginee non calcificate. Una riduzione del numero totale di condrociti e, soprattutto, una perdita nel numero di matrici che producono condrociti.
Si osservano anche cambiamenti alla superficie articolare, indicativi della gravità dell'erosione, tra cui un aumento complessivo dell'indice di fibrillazione. L'osteoartrite include anche un aumento dell'area ossea subcondrale e una riduzione dell'area dello spazio del midollo osseo nei topi DMM che indicano la sclerosi ossea subcondrale. Sia le aree osteofite anteriori che posteriori sono aumentate anche nei topi DMM, suggerendo un rimodellamento osseo subcondrale in corso che funge da meccanismo compensativo per gestire i cambiamenti nel carico articolare nel sito della lesione.
L'analisi istomorfometrica del sinovio mostra un aumento dello spessore sinoviale nei topi DMM. Un risultato tipico dell'osteoartrite associata all'infiammazione sinoviale e alla diffusione delle citochine infiammatorie nello spazio articolare. Inoltre, non si osserva alcuna significativa variabilità tra gli utenti tra l'analisi istomorfometrica dell'area cartilaginea non calcificata nel punteggio Osteoarthritis Research Society International.
Dopo l'analisi istomorfometrica, le diapositive sequenziali e la colorazione dell'immunofluorescenza possono essere utilizzate per esaminare i cambiamenti nell'espressione proteica tra i campioni.
