Notre protocole répond à un besoin non satisfait d’une méthode robuste et reproductible pour l’analyse quantitative des changements articulaires dans le développement et la progression de l’arthrose. Notre technique décrit des paramètres spécifiques et reproductibles pour l’analyse quantitative des changements dans les tissus articulaires multiples dans l’arthrose. Comme cette technique permet une analyse quantitative de l’arthrose, elle peut être utilisée pour comparer les effets de traitements spécifiques sur plusieurs tissus articulaires afin d’évaluer leur efficacité thérapeutique.
Notre protocole peut également être appliqué à d’autres modèles d’arthrose ou à des domaines de recherche musculo-squelettique dans lesquels la quantification du cartilage et de l’os est nécessaire. Bien que le système soit simple et intuitif, des sessions de formation sont encore nécessaires pour pratiquer l’obtention de mesures de manière répétée pour atteindre la reproductibilité. Vengadeshprabhu Karuppagounder, un chercheur postdoctoral de notre laboratoire va maintenant démontrer notre procédure.
Commencez par allumer le microscope, la caméra, l’ordinateur et le moniteur d’écran tactile. Sélectionnez l’objectif 4X et cliquez sur l’icône logicielle pour lancer le logiciel. Placez la diapositive sur le stade du microscope et centrez l’échantillon à l’intérieur de la fenêtre de mesure en veillant à ce que la grille de mesure soit réglée au grossissement approprié pour correspondre à l’objectif en ce que la surface articulaire tibiale et fémorale et l’os subchondral tibial sont inclus dans les régions d’image d’intérêt.
Ensuite, sous le menu Fichier, sélectionnez Paramètres de lecture. Dans la fenêtre Paramètres, sélectionnez le fichier paramètres approprié pour mesurer les paramètres. Pour mesurer la surface totale du cartilage, sélectionnez la fonction Tib TC et tracez le long du bord supérieur de la surface du cartilage tibial où le cartilage rencontre l’espace articulaire et le long de la jonction chondro-osseous où le cartilage calcifié rencontre l’os subchondral.
Pour mesurer la zone calcifiée du cartilage, sélectionnez la fonction Tib CC et tracez une ligne le long de la marque de marée, une ligne naturelle séparant les régions calcifiées et non calcifiées du cartilage, et le long de la jonction chondro-osseous où le cartilage calcifié rencontre l’os subchondral. Pour déterminer la zone non calcalcifiée du cartilage, soustrayez la zone calcifiée du cartilage de la zone totale du cartilage. Pour déterminer le nombre de chondrocytes, créez des fonctions de comptage distinctes dans les paramètres du logiciel d’histomorphométrie pour distinguer la matrice produisant et matricielle des chondrocytes non productifs.
Ensuite, utilisez le stylet pour faire un petit point sur chaque chondrocyte exprimant le phénotype spécifié pour déterminer le nombre de matrices produisant ou ne produisant pas de chondrocytes. Pour mesurer le paramètre total de surface articulaire tibiale, tracez une ligne à travers la surface du cartilage tibial pour définir soigneusement les fibrillations individuelles. Puis tracez une deuxième ligne le long de la marque de marée pour servir de contrôle interne pour le plan de chaque section et diviser le paramètre de surface articulaire tibiale par le paramètre de la marque de marée pour calculer l’indice de fibrillation de surface articulaire tibiale.
Pour mesurer la zone spatiale subchondral de moelle, sélectionnez la fonction zone de moelle. Puis tracer des lignes autour du paramètre de ces zones pour déterminer la zone totale de l’espace de moelle osseuse dans l’os sous-chondral tibial. Pour mesurer la zone subchondral totale, sélectionnez la fonction d’os subchondral et décrivent la région entre la jonction chondro-osseous dans la frontière supérieure de la plaque de croissance s’étendant latéralement aux régions des ostéophytes antérieurs et postérieurs.
Puis soustrayez la zone d’espace subchondral de moelle de la zone subchondral totale pour calculer la zone subchondral d’os. Pour mesurer la zone ostéophyte, sélectionnez la fonction ostéophyte antérieure et tracez l’ostéophyte antérieur du tibia proximal. Sélectionnez ensuite l’ostéophyte postérieur et tracez l’ostéophyte postérieur du tibia proximal.
Pour mesurer l’épaisseur synoviale fémorale antérieure, cliquez sur Le Ménisque antérieur de Synovium de Fémur et tracez une ligne du point d’insertion interne du synovium antérieur sur le fémur vers son point d’attachement sur le ménisque et une ligne de l’insertion externe du synovium sur le fémur vers son attachement au ménisque. Divisez ensuite la zone synoviale totale par le paramètre synovial pour calculer l’épaisseur synoviale. L’arthrose induite par le DMM entraîne une augmentation du score de la Société internationale de recherche sur l’arthrose par rapport aux souris factices.
Nettement caractérisé par l’érosion de surface et le cartilage perdu. Ce protocole d’histomorphométrie peut être utilisé pour détecter plusieurs changements associés à l’arthrose, y compris une diminution du cartilage total et des zones cartilagineux noncalcifiées. Une réduction du nombre total de chondrocytes et, surtout, une perte du nombre de matrices produisant des chondrocytes.
Des changements à la surface articulaire, indicatifs de la gravité de l’érosion, sont également observés, y compris une augmentation globale de l’indice de fibrillation. L’arthrose comprend également une augmentation de la zone osseuse subchondral et une réduction de la zone de l’espace de moelle osseuse chez les souris DMM indiquant la sclérose osseuse subchondral. Les secteurs antérieurs et postérieurs d’osteophyte ont également augmenté chez les souris de DMM, suggérant un remodelage subchondral continu d’os qui agit comme mécanisme compensatoire pour manipuler des changements dans la charge commune au site de la blessure.
L’analyse histomorphométrique du synovium montre une augmentation de l’épaisseur synoviale chez les souris DMM. Un résultat typique de l’ostéoarthrite a associé l’inflammation synoviale et la diffusion des cytokines inflammatoires dans l’espace commun. En outre, aucune variabilité inter-utilisateur significative entre l’analyse histomorphométrique de la zone noncalcifiée de cartilage dans le score international d’Osteoarthritis Research Society n’est observée.
Après analyse histomorphométrique, des diapositives séquentielles et des taches d’immunofluorescence peuvent être utilisées pour examiner les changements dans l’expression des protéines entre les échantillons.
