В нашем протоколе рассматривается неудовлетворенная потребность в надежном и воспроизводимом методе количественного анализа изменений суставов при развитии и прогрессировании остеоартрита. Наша методика определяет конкретные и воспроизводимые параметры количественного анализа изменений в тканях нескольких суставов при остеоартрите. Поскольку этот метод позволяет количественного анализа остеоартрита, он может быть использован для сравнения воздействия конкретных методов лечения на несколько тканей суставов, с тем чтобы оценить их терапевтическую эффективность.
Наш протокол также может быть применен к другим моделям остеоартрита или областям исследований опорно-двигательного мозга, в которых необходима количественная оценка хряща и кости. Хотя эта система проста и интуитивно понятна, учебные занятия по-прежнему необходимы для повторного получения измерений для достижения воспроизводимости. Vengadeshprabhu Karuppagounder, докторант из нашей лаборатории теперь будет демонстрировать нашу процедуру.
Начните с включением монитора микроскопа, камеры, компьютера и сенсорного экрана. Выберите цель 4X и нажмите значок программного обеспечения для запуска программного обеспечения. Поместите слайд на стадии микроскопа и центр образца в окне измерения обеспечения того, чтобы сетка измерения установлена на надлежащее увеличение, чтобы соответствовать цели в том, что как тибиальной и бедренной суставной поверхности и тибиальной субхондральной кости включены в области изображения интерес.
Затем в меню Файла выберите Настройки чтения. В окне Настройки выберите соответствующий файл настроек для измеренных параметров. Чтобы измерить общую площадь хряща, выберите функцию Tib TC и проследите вдоль верхнего края поверхности хряща, где хрящ встречается с суставным пространством и вдоль хондро-оссейного соединения, где кальциновый хрящ встречается с субхондральной костью.
Для измерения кальцинифицированной области хряща выберите функцию Tib CC и проследите линию вдоль отметки прилива, естественной линии, разделяющей кальцинифицированные и некалифицированные области хряща, и вдоль хондро-оссейного соединения, где кальцинифицированный хрящ встречается с субхондральной костью. Чтобы определить некалифицированную область хряща, вычесть кальцинифицированную область хряща из общей области хряща. Чтобы определить число хондроцитов, создайте отдельные функции подсчета в настройках в программном обеспечении гистоморфометрии, чтобы отличить матрицу производства и матрицы не-производящих хондроцитов.
Затем используйте стилус, чтобы сделать небольшую точку над каждым хондроцитом, выражают указанный фенотип, чтобы определить количество матриц, производящих или не производящих хондроциты. Чтобы измерить общий параметр поверхности мибия, проследите линию по всей поверхности хряща, чтобы тщательно определить отдельные фибрилляции. Затем нарисуйте вторую линию вдоль отметки прилива, чтобы служить внутренним контролем для плоскости каждого участка и разделить параметр поверхности трибиаля по параметру отметки прилива для расчета индекса фибрилляции поверхности трибия.
Для измерения области пространства субхондриального мозга выберите функцию зоны костного мозга. Затем нарисуйте линии вокруг параметра этих областей, чтобы определить общую площадь пространства костного мозга в подхондриальной кости. Для измерения общей субхондральной области выберите функцию субхондральной кости и наметьте область между хондро-оссеозным соединением в верхней границе пластины роста, простирающейся боковой к регионам переднего и заднего остеофитов.
Затем вычесть область пространства субхондриального костного мозга из общей субхондриальной области для расчета субхондриальной области кости. Для измерения остеофитной области выберите передняя остеофитная функция и проследите передний остеофит проксимальной голени. Затем выберите задний остеофит и проследить задний остеофит проксимальной голени.
Чтобы измерить переднюю бедренную синовиаловую толщину, щелкните передней бедренной оболочки synovium Meniscus и нарисуйте одну линию от внутренней точки вставки переднего синовия на бедренной кости к точке крепления мениска и одну линию от внешней вставки синовиума на бедренной кости к его привязанности к мениска. Затем разделите общую синовиаловую область на синовиальный параметр для расчета синовиальной толщины. DMM индуцированных остеоартрита приводит к увеличению остеоартрита Научно-исследовательское общество Международный балл по сравнению с фиктивных мышей.
Отчетливо характеризуется эрозией поверхности и потерянным хрящом. Этот протокол гистоморфометрии может быть использован для обнаружения нескольких остеоартрит связанных изменений, включая уменьшение общего хряща и некалифицированных областей хряща. Снижение общего числа хондроцитов и, что важно, потеря количества матриц, производящих хондроциты.
Наблюдаются также изменения поверхности суставов, свидетельствующие о серьезности эрозии, включая общее увеличение индекса фибрилляции. Остеоартрит также включает в себя увеличение области субхондриальной кости и уменьшение площади пространства костного мозга у мышей ДММ, указывающих на субхондриальный склероз костей. Как передние, так и задние области остеофита также увеличились у мышей ДММ, что свидетельствует о продолжающейся подхондриальной ремоделирования костей, которая выступает в качестве компенсационного механизма для обработки изменений в совместной нагрузке в месте травмы.
Гистоморфометрический анализ синовия показывает увеличение толщины синовиальной клетки у мышей ДММ. Типичным исходом остеоартрита связано синовиальное воспаление и диффузия воспалительных цитокинов в суставное пространство. Кроме того, не наблюдается существенной межвидовой изменчивости между гистоморфометрическим анализом некалифицированной области хряща в международном исследовании остеоартрита.
После гистоморфометрического анализа для изучения изменений экспрессии белка между образцами могут использоваться последовательные слайды и окрашивание иммунофлюоресценции.
