Unser Protokoll behebt den unerfüllten Bedarf an einer robusten und reproduzierbaren Methode zur quantitativen Analyse von Gelenkveränderungen in der Entwicklung und Progression von Arthrose. Unsere Technik skizziert spezifische und reproduzierbare Parameter für die quantitative Analyse von Veränderungen in mehreren Gelenkgeweben bei Arthrose. Da diese Technik eine quantitative Analyse von Arthrose ermöglicht, kann es verwendet werden, um die Auswirkungen spezifischer Behandlungen auf mehrere Gelenkgewebe zu vergleichen, um ihre therapeutische Wirksamkeit zu bewerten.
Unser Protokoll kann auch auf andere Arthrose-Modelle oder Bereiche der Muskel-Skelett-Forschung angewendet werden, in denen Quantifizierung von Knorpel und Knochen erforderlich ist. Obwohl das System einfach und intuitiv ist, sind Trainingseinheiten immer noch notwendig, um zu üben, Messungen in wiederholter Weise zu erhalten, um Reproduzierbarkeit zu erreichen. Vengadeshprabhu Karuppagounder, ein Postdoktorand aus unserem Labor, wird nun unser Verfahren demonstrieren.
Beginnen Sie mit dem Einschalten des Mikroskops, der Kamera, des Computers und des Touchscreen-Monitors. Wählen Sie das 4X-Ziel aus und klicken Sie auf das Softwaresymbol, um das Softwareprogramm zu starten. Platzieren Sie das Dia auf der Mikroskopbühne und zentrieren Sie die Probe innerhalb des Messfensters, um sicherzustellen, dass das Messraster auf die richtige Vergrößerung eingestellt ist, um dem Ziel zu entsprechen, dass sowohl die titorische als auch die femorale Gelenkoberfläche und der tibiale subchondrale Knochen in die von Interesse sindden Bildbereiche einbezogen werden.
Wählen Sie dann im Menü Datei die Option Leseeinstellungen aus. Wählen Sie im Fenster Einstellungen die entsprechende Einstellungsdatei für die zu messenden Parameter aus. Um die gesamte Knorpelfläche zu messen, wählen Sie die Tib TC-Funktion aus und verfolgen Sie entlang der oberen Kante der tibialen Knorpeloberfläche, wo der Knorpel auf den Gelenkraum trifft, und entlang der chondro-osseösen Kreuzung, wo verkalkter Knorpel auf den subchondralen Knochen trifft.
Um den verkalkten Knorpelbereich zu messen, wählen Sie die Tib CC-Funktion aus und verfolgen Sie eine Linie entlang der Gezeitenmarke, eine natürlich vorkommende Linie, die die verkalkten und unkalzinsierten Knorpelbereiche trennt, und entlang der chondro-osseous Kreuzung, wo der verkalkte Knorpel auf den subchondralen Knochen trifft. Um die unkalkulierte Knorpelfläche zu bestimmen, subtrahieren Sie die verkalkte Knorpelfläche von der gesamten Knorpelfläche. Um die Chondrozytenzahl zu bestimmen, erstellen Sie separate Zählfunktionen innerhalb der Einstellungen in der Histomorphometrie-Software, um die Matrix produzierende und Matrix nicht produzierende Chondrozyten zu unterscheiden.
Verwenden Sie dann den Stift, um einen kleinen Punkt über jedem Chondrozyten zu machen, der den angegebenen Phänotyp ausdrückt, um die Anzahl der Matrix zu bestimmen, die Chondrozyten produziert oder nicht produziert. Um den gesamten tibialen Gelenkoberflächenparameter zu messen, verfolgen Sie eine Linie über die Oberfläche des tibialen Knorpels, um die einzelnen Vorhofflimmern sorgfältig zu definieren. Zeichnen Sie dann eine zweite Linie entlang der Gezeitenmarke, um als interne Kontrolle für die Ebene jedes Abschnitts zu dienen, und teilen Sie den parameter der tiialen Artikulenoberfläche durch den Gezeitenmarkierungsparameter, um den tibialen Gelenkoberflächenflimmerindex zu berechnen.
Um den Subchondralmarkbereich zu messen, wählen Sie die Funktion Marrow Area aus. Zeichnen Sie dann Linien um den Parameter dieser Bereiche, um die Gesamtfläche des Knochenmarkraums innerhalb des tibialen subchondralen Knochens zu bestimmen. Um die gesamte subchondrale Fläche zu messen, wählen Sie die Subchondral Bone-Funktion aus und skizzieren Sie den Bereich zwischen der chondro-osseous Kreuzung in der oberen Grenze der Wachstumsplatte, die sich seitlich auf die Regionen der vorderen und hinteren Osteophyten erstreckt.
Subchondraler Knochenmarkraumbereich wird dann von der gesamten subchondralen Fläche subchondral subtrahiert, um den subchondralen Knochenbereich zu berechnen. Um den Osteophytenbereich zu messen, wählen Sie die vordere Osteophytenfunktion aus und verfolgen Sie den vorderen Osteophyten der proximalen Tibia. Wählen Sie dann den hinteren Osteophyten aus und verfolgen Sie den hinteren Osteophyten der proximalen Tibia.
Um die vordere femorale Synovialdicke zu messen, klicken Sie auf Anterior Femur Synovium Meniscus und ziehen Sie eine Linie von der inneren Einfügemarke des vorderen Synoviums auf dem Oberschenkelknochen in Richtung seines Befestigungspunkts am Meniskus und einer Linie von der äußeren Einfügung des Synoviums auf den Oberschenkelknochen in Richtung seiner Befestigung am Meniskus. Dividieren Sie dann den gesamten Synovialbereich durch den Synovialparameter, um die Synovialdicke zu berechnen. DMM induzierte Arthrose führt zu einem erhöhten Osteoarthritis Research Society International Score im Vergleich zu Scheinmäusen.
Deutlich gekennzeichnet durch Oberflächenerosion und Knorpelverlust. Dieses Histomorphometrie-Protokoll kann verwendet werden, um mehrere Arthrose-assoziierte Veränderungen zu erkennen, einschließlich einer Abnahme des gesamten Knorpels und unkalkulierten Knorpelbereiche. Eine Verringerung der Gesamtenchdrozytenzahl und vor allem ein Verlust in der Anzahl der Matrix produzierenden Chondrozyten.
Es werden auch Veränderungen der Gelenkoberfläche beobachtet, die auf die Schwere der Erosion hinweisen, einschließlich einer allgemeinen Zunahme des Fibrillationsindex. Osteoarthritis beinhaltet auch eine Zunahme des subchondralen Knochenbereichs und eine Verringerung des Bereichs des Knochenmarkraums bei DMM-Mäusen, die auf subchondrale Knochensklerose hinweisen. Sowohl die vorderen als auch die hinteren Osteophytenbereiche nahmen auch bei DMM-Mäusen zu, was auf eine laufende subchondrale Knochenumgestaltung hindeutet, die als Kompensatormechanismus dient, um Veränderungen der Gelenkbelastung an der Unfallstelle zu bewältigen.
Die histomorphometrische Analyse des Synoviums zeigt eine Zunahme der Synovialdicke bei DMM-Mäusen. Ein typisches Ergebnis von Arthrose assoziiert Synovialentzündung und die Diffusion von entzündlichen Zytokinen in den Gelenkraum. Darüber hinaus wird keine signifikante Inter-User-Variabilität zwischen der histomorphometrischen Analyse des unkalkulierten Knorpelbereichs im Ergebnis der Osteoarthritis Research Society International beobachtet.
Nach der histomorphometrischen Analyse können sequentielle Dias und Immunfluoreszenzfärbungen verwendet werden, um Veränderungen in der Proteinexpression zwischen Proben zu untersuchen.
