Nuestro protocolo utilizó ARN-Seq y herramientas bioinformáticas para descubrir rápidamente los genes controladores sobreexpresados que contribuyen a la formación de tumores colorrectales similares a tallos. Este protocolo se utiliza para examinar un gen expresado diferencialmente y vías de señal para investigar un mecanismo molecular para el tallo del cáncer en un cáncer colorrectal selectivo. En el séptimo día de cultivo, utilice un microscopio invertido con un sistema de imágenes celulares digitales para observar y medir el diámetro de las tumoresferas.
Cuando las tumoresferas alcancen un diámetro superior a 100 micrómetros, trate el cultivo con 0,25% de trippsina. Después de cinco minutos a 37 grados Celsius, neutralice la trippsina con el doble de volumen de medio de crecimiento y cuente las células usando un hemocitociómetro. Recoger las células por centrifugación.
Y resuspender el pellet a cinco veces 10 a las cuatro células por cada 100 microlitros de concentración media. Añadir dos microlitros del anticuerpo primario de interés a cada tubo e incubar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente y 200 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, lavar cada tubo con 900 microlitros de PBS y analizar las células para la expresión de la proteína de interés por citometría de flujo de acuerdo con protocolos estándar.
Para el aislamiento de ARN después de la recolección de tripina como acaba de demostrar, resuspender las células a dos veces 10 a las células quintas por 50 microlitros de concentración de PBS y lise cada muestra con 200 microlitros de tampón de lisis complementado con dos microlitros de tubo de peraptoetanol beta. Después de un breve vórtice y una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, recoger los licatos por centrifugación y añadir 200 microlitros de 70% etanol a cada tubo. Transfiera las muestras a columnas rápidas y retire el disolvente por centrifugación.
Lavar las muestras con 400 microlitros de solución de lavado uno y 600 microlitros de solución de lavado dos para eliminar completamente cualquier no ARN por centrifugación, seguido de dos minutos adicionales centrifugación en las mismas condiciones de centrífuga para eliminar cualquier etanol residual. A continuación, resuspender los pellets en 50 microlitros de agua destilada por tubo y centrifugar la muestra durante un minuto antes de recoger el ARN que contiene sobrenadantes. Investigar la expresión génica diferencial entre las células de la tumorsfera en comparación con las células tumorales parentales después del análisis de secuenciación de ARN.
Seleccione genes con un cambio de pliegue de más de uno a menos un log2 con recuentos de lectura superiores a 100 en la tumorsfera y los grupos parentales. Y usa los comandos como se indica. Obtener una gráfica volcánica de los datos para determinar la expresión génica diferencial.
Para la selección de genes de accionamiento en el analista de red, seleccione la entrada de un solo gen y copie y pegue los genes sobreexpresados seleccionados con el ser humano especificado como el organismo y el símbolo genético oficial como el tipo de identificación. Haga clic en Cargar y continúe. Para insertar y analizar los datos mediante la interacción proteína-proteína, después de la interacción proteína-proteína genética, utilice la base de datos de interactoma STRING con una puntuación de confianza cortada de 900 para mostrar los genes de semillas.
Cruzar los genes cargados. Los genes de semillas que se asocian con más genes individuales se pueden seleccionar como genes conductores que pueden estar involucrados en el mantenimiento de la formación de la tumorsfera. Seleccione Continuar en la vista general de asignación en blanco en el Fondo y Forzar Atlas en el botón Diseño.
A continuación, seleccione par base PANTHER para analizar el grupo genético de regulación ascendente. Tumoresesferas de más de 100 micrómetros de diámetro se forman dentro de los siete días de cultivo. El análisis citométrico de flujo revela un aumento en la expresión LGR5 y CD133 en tumores de origen HT29 en comparación con las células HT29 parentales.
Después de la secuenciación de ARN, los genes con un cambio de plegado de log2 superior en su regulación hacia arriba o hacia abajo con un valor P inferior a 0,05 según lo determinado por el mapa de calor se pueden trazar para distinguir los genes significativos entre las tumoresferas derivadas de HT29 y las células HT29 parentales. En este experimento representativo, el análisis de los genes regulados con un pliegue de log2 superior a un máximo de 10 genes de semillas, que reticulaban las redes genéticas. El análisis del par base de PANTHER indicó que dos genes estaban asociados con la regulación negativa de la apoptosis.
Además, los genes seleccionados fueron validados por PCR cuantitativo confirmando su mayor expresión en tumoresferas derivadas de HT29. La selección diferencial del gen es el paso más importante de los procedimientos. Recuerde utilizar un cambio de pliegue log2 mayor que uno con recuentos mayores que 100 como criterios.
Usando este protocolo, los genes seleccionados de las tumoresferas de origen colorrectal pueden ser derribados o sobreexpresados para descubrir sus funciones potenciales en la formación de tumoresferas.
