הפרוטוקול שלנו השתמש בכלים RNA-Seq וביואינפורמציה כדי לחשוף במהירות את הגנים המודחסים יתר על המידה של הנהג התורמים להיווצרות גידולים המעיים דמויי גזע. פרוטוקול זה משמש כדי לסנן מסלולים גנים ואותות מבוטאים באופן דיפרנציאלי כדי לחקור מנגנון מולקולרי עבור גזע סרטן בסרטן המעי הגס סלקטיבי. ביום השביעי לתרבות, השתמש במיקרוסקופ הפוך עם מערכת דימות תאים דיגיטלית כדי לבחון ולמדוד את קוטר הגידולים.
כאשר הגידולים מגיעים לקוטר של יותר מ -100 מיקרומטר, לטפל בתרבות עם 0.25% טריפסין. לאחר חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לנטרל את טריפסין עם פעמיים את נפח הצמיחה בינוני לספור את התאים באמצעות המוציטמטר. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.
ולתלות מחדש את גלולה בחמש פעמים 10 לארבעת התאים לכל 100 microliters של ריכוז בינוני. מוסיפים שני מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי המעניין כל צינור ומדרגים את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ו-200 מהפכות בדקה. בסוף הדגירה, לשטוף כל צינור עם 900 microliters של PBS ולנתח את התאים לביטוי של חלבון עניין על ידי ציטומטריה זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
לבידוד RNA לאחר איסוף טריפסין כפי שהודגם זה בלבד, יש להשתמש שוב בתאים במהירות של פי 2 עד 10 עד התאים החמישיים לכל 50 מיקרוליטרים של ריכוז PBS ולתלות כל דגימה עם 200 מיקרוליטרים של מאגר תיזה בתוספת שני מיקרוליטרים של בטא mercaptoethanol לצינור. לאחר מערבולת קצרה ודגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את lysates על ידי צנטריפוגה ולהוסיף 200 microliters של 70% אתנול לכל צינור. להעביר את הדגימות לתוך עמודות מהירות ולהסיר את הממס על ידי צנטריפוגה.
לשטוף את הדגימות עם 400 microliters של פתרון לשטוף אחד ו 600 microliters של פתרון לשטוף שני כדי להסיר לחלוטין כל שאינו RNA על ידי צנטריפוגה, ואחריו צנטריפוגה שתי דקות נוספות תחת אותם תנאי צנטריפוגה כדי להסיר כל אתנול שיורית. לאחר מכן תבזבזו מחדש את הכדורים ב-50 מיקרוליטרים של מים מזוקקים לצינור ויצפו את הדגימה למשך דקה אחת לפני איסוף ה-RNA המכיל על-טבעי. כדי לחקור את ביטוי הגן דיפרנציאלי בין תאים tumorsphere לעומת תאים סרטניים הורים לאחר ניתוח רצף RNA.
בחר גנים עם שינוי קיפול אחד עד מינוס אחד עם ספירת קריאה גדולה מ -100 בגידולים ובקבוצות ההורים. ולהשתמש בפקודות כפי שצוין. כדי להשיג חלקת הר געש של הנתונים כדי לקבוע את ביטוי הגן דיפרנציאלי.
עבור בחירת גנים כונן אנליסט רשת, בחר קלט גנים יחיד להעתיק ולהדביק את הגנים המודחסים יתר על כן שנבחרו עם האדם שצוין כאורגניזם וסמל הגן הרשמי כסוג הזיהוי. לחץ על העלה והמשך. כדי להכניס ולנתח את הנתונים באמצעות אינטראקציה בין חלבון לחלבון, לאחר אינטראקציה גנטית בין חלבונים לחלבון, השתמש במסד הנתונים INTERACTOME STRING עם ציון ביטחון שנחתך מ- 900 כדי להראות את הגנים של הזרעים.
הצלבת הגנים שהועלו. ניתן לבחור את גנים הזרעים הקשורים לגנים אינדיבידואליים יותר כגנים נהגים שעשויים להיות מעורבים בשמירה על היווצרות הגידולים. בחר המשך בסקירת המיפוי בלבן בתצוגת רקע ואלץ אטלס בכוח הפריסה.
לאחר מכן בחר זוג בסיס PANTHER כדי לנתח את קבוצת הגנים upregulation. גידולים בקוטר של יותר מ-100 מיקרומטרים נוצרים תוך שבעה ימים מתרבות. ניתוח ציטומטרי זרימה מגלה עלייה בביטוי LGR5 ו- CD133 בגידולים המופקים HT29 בהשוואה לתאי HT29 הורים.
לאחר רצף RNA, הגנים עם שינוי קיפול log2 אחד יותר שלהם למעלה או downregulation עם ערך P פחות מ 0.05 כפי שנקבע על ידי מפת חום ניתן לתכנן כדי להבחין בין הגנים המשמעותיים בין HT29 נגזר tumorspheres ותאי HT29 ההורים. בניסוי מייצג זה, ניתוח של הגנים מוסדר עם קיפול log2 אחד הביא 10 גנים זרעים, הצלבת רשתות הגנים. ניתוח זוג בסיס PANTHER הצביע על כך ששני גנים היו קשורים עם ויסות שלילי של אפופטוזיס.
יתר על כן, הגנים שנבחרו אומתו כתוצאה מכך על ידי PCR כמותי המאשר את הביטוי המוגבר שלהם בגידולים המופקים HT29. בחירת הגנים המהופרים היא השלב החשוב ביותר בהליכים. זכור להשתמש בשינוי קיפול log2 הגדול משינוי עם ספירות חוזרות הגדולות מ- 100 כקריטריונים.
באמצעות פרוטוקול זה, הגנים שנבחרו מן הגידולים שמקורם המעיים ניתן להפיל או overexpressed כדי לחשוף את התפקידים הפוטנציאליים שלהם היווצרות tumorsphere.
