استخدم بروتوكولنا أدوات الحمض النووي الريبي النووي -RNA-Seq والكائنات الحيوية للكشف بسرعة عن جينات السائق المفرطة التي تساهم في تكوين أورام القولون والمستقيم الشبيهة بالسيقان. يستخدم هذا البروتوكول لفحص الجينات المعبّر عنها بشكل تفاضلي ومسارات الإشارة للتحقيق في آلية جزيئية لرقي السرطان في سرطان القولون والمستقيم الانتقائي. في اليوم السابع من الثقافة، استخدم مجهرًا مقلوبًا مع نظام تصوير الخلايا الرقمية لمراقبة وقياس قطر أورام الفير.
عندما تصل إلى أورامفيرز أكبر من 100 ميكرومتر قطر, علاج الثقافة مع 0.25٪ التربسين. بعد خمس دقائق في 37 درجة مئوية، تحييد التربسين مع ضعف حجم متوسط النمو وعد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
و resuspend بيليه في خمس مرات 10 إلى الخلايا الأربع لكل 100 ميكرولترات من التركيز المتوسط. إضافة اثنين من microliters من الأجسام المضادة الأولية من الفائدة لكل أنبوب واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 200 الثورات في الدقيقة الواحدة. في نهاية الحضانة، وغسل كل أنبوب مع 900 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني وتحليل الخلايا للتعبير عن البروتين من الفائدة عن طريق تدفق cytometry وفقا للبروتوكولات القياسية.
لعزل RNA بعد جمع التربسين كما هو موضح للتو، resuspend الخلايا في مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 50 ميكرولترات من تركيز PBS وlyse كل عينة مع 200 ميكرولترات من العازلة تحلل تكملها اثنين من microliters من بيتا mercaptoethanol لكل أنبوب. بعد دوامة وجيزة واحتضان خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع lysates عن طريق الطرد المركزي وإضافة 200 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول إلى كل أنبوب. نقل العينات إلى أعمدة سريعة وإزالة المذيبات عن طريق الطرد المركزي.
اغسل العينات بـ 400 ميكرولترات من محلول الغسيل واحد و600 ميكرولترات من محلول الغسيل اثنين لإزالة أي غير RNA تمامًا عن طريق الطرد المركزي ، يليه طرد مركزي لمدة دقيقتين إضافيتين في ظل نفس شروط الطرد المركزي لإزالة أي إيثانول متبقي. ثم إعادة تعليق الكريات في 50 ميكرولترات من الماء المقطر لكل أنبوب والطرد المركزي العينة لمدة دقيقة واحدة قبل جمع الحمض النووي الريبي التي تحتوي على عظمى. للتحقيق في التعبير الجيني التفاضلي بين خلايا أورام في الغلاف الجوي مقارنة بالخلايا السرطانية الأبوية بعد تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي.
حدد الجينات مع أكبر من واحد إلى ناقص واحد log2 أضعاف التغيير مع عدد القراءة أكبر من 100 في أوراموسفير ومجموعات الوالدين. واستخدم الأوامر كما هو مبين. للحصول على مؤامرة بركان من البيانات لتحديد التعبير الجيني التفاضلي.
لاختيار جينات محرك الأقراص في محلل الشبكة، حدد إدخال الجينات المفردة ونسخ ولصق الجينات المُختارة التي تم التعبير عنها بشكل مفرط مع تحديد الإنسان ككائن حي ورمز جين رسمي كنوع المعرّف. انقر فوق تحميل والمضي قدما. لإدراج وتحليل البيانات باستخدام البروتين البروتين التفاعل، بعد التفاعل البروتين الجيني البروتين، واستخدام قاعدة بيانات التفاعل STRING مع درجة الثقة قطع من 900 لإظهار الجينات البذور.
عبر ربط الجينات التي تم تحميلها. ويمكن اختيار الجينات البذور المرتبطة مع المزيد من الجينات الفردية كما الجينات السائق التي قد تشارك في الحفاظ على تشكيل أوراموسفير. حدد متابعة في تعيين نظرة عامة بيضاء في الخلفية وأطلس فرض في مقبض التخطيط.
ثم حدد زوج قاعدة PANTHER لتحليل مجموعة جينات رفع التنظيم. أورام أفصال أكبر من 100 ميكرومتر في شكل قطرها في غضون سبعة أيام من الثقافة. تحليل تدفق cytometric يكشف عن زيادة في التعبير LGR5 و CD133 في HT29-اشتقاق الأورام مقارنة مع الخلايا HT29 الوالدين.
بعد تسلسل الحمض النووي الريبي، الجينات مع أكبر من واحد log2 أضعاف التغيير في صعودا أو داونلوراس مع قيمة P أقل من 0.05 كما تحددها خريطة الحرارة يمكن رسمها لتمييز الجينات الهامة بين الأورام المشتقة من HT29 والخلايا HT29 الوالدين. في هذه التجربة التمثيلية، أدى تحليل الجينات المُرقَّبة التي يزيد عددها عن 11 ضعفًا إلى وجود 10 جينات بذرة، وربط الشبكات الجينية. أشار تحليل الزوج قاعدة بانثر أن اثنين من الجينات المرتبطة التنظيم السلبي لتخثر الدم.
وعلاوة على ذلك، تم التحقق من صحة الجينات المختارة بالتالي بواسطة PCR الكمية التي تؤكد زيادة التعبير عنها في HT29-اشتقاق الأورام. اختيار الجينات التفاضلية هو أهم خطوة في الإجراءات. تذكر أن تستخدم log2 أضعاف تغيير أكبر من واحد مع إعادة فرز أكبر من 100 كمعايير.
باستخدام هذا البروتوكول، يمكن إسقاط الجينات المختارة من أورام القولون والمستقيم أو التعبير عنها بشكل مفرط للكشف عن أدوارها المحتملة في تكوين أورامفير.
