Наш протокол использовал РНК-Сек и биоинформатические инструменты, чтобы быстро выявить переэкспрессивные гены драйверов, которые способствуют образованию стволовых колоректальных опухолевыхсфер. Этот протокол используется для проверки дифференциально выраженных генов и сигнальных путей для исследования молекулярного механизма ствола рака при селективном колоректального рака. На седьмой день культуры используйте перевернутый микроскоп с цифровой системой визуализации клеток для наблюдения и измерения диаметра опухолевыхсфер.
Когда диаметр опухолевых культур достигает более 100 микрометров, обработать культуру 0,25%трипсином. Через пять минут при 37 градусах По Цельсию нейтрализуйте трипсин с двукратным объемом среды роста и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Соберите клетки путем центрифугации.
И повторно использовать гранулы в пять раз от 10 до четырех клеток на 100 микролитров средней концентрации. Добавьте два микролитера первичного антитела, представляющие интерес для каждой трубки, и инкубировать клетки в течение 30 минут при комнатной температуре и 200 оборотов в минуту. В конце инкубации, мыть каждую трубку с 900 микролитров PBS и анализировать клетки для выражения белка интереса по потоку цитометрии в соответствии со стандартными протоколами.
Для изоляции РНК после сбора трипсина, как только что продемонстрировано, повторное распределение клеток в два раза от 10 до пятых клеток на 50 микролитров концентрации PBS и lyse каждый образец с 200 микролитров буфера лиза дополнены двумя микролитров бета меркаптоэтанола на трубку. После краткого вихря и пятиминутной инкубации при комнатной температуре, соберите лизаты центрифугации и добавьте 200 микролитров 70% этанола в каждую трубку. Перенесите образцы в быстрые колонны и удалите растворитель путем центрифугации.
Вымойте образцы с 400 микролитров раствора для мытья 1 и 600 микролитров раствора для мытья два, чтобы полностью удалить любые не-РНК центрифугации, а затем дополнительные две минуты центрифугации в тех же условиях центрифуги для удаления любого остаточного этанола. Затем повторно посовестить гранулы в 50 микролитров дистиллированной воды на трубку и центрифуги образца в течение одной минуты, прежде чем собирать РНК, содержащую супернатанты. Исследовать экспрессию дифференциального гена между опухолевыми клетками по сравнению с родительскими опухолевыми клетками после анализа секвенирования РНК.
Выберите гены с более чем от одного до минус одного изменения лог2 раза с чтением насчитывает более 100 в опухолевой сфере и родительских групп. И использовать команды, как указано. Для получения вулкана участок данных для определения дифференциальной экспрессии генов.
Для выбора генов диска в сетевом аналитике выберите единый вход генов и скопировать и вставить выбранные переэкспрессивные гены с человеческими, указанными как организм и официальный символ гена как тип идентификатора. Нажмите Загрузить и продолжить. Чтобы вставить и проанализировать данные с помощью взаимодействия белка и белка, после генетического взаимодействия белка и белка, используйте базу данных STRING interactome с показателем доверия, отрезанным от 900, чтобы показать гены семян.
Перекрестное связывание загруженных генов. Гены семян, связывающиеся с более отдельными генами, могут быть выбраны в качестве генов-драйверов, которые могут быть вовлечены в поддержание формирования опухолевой сферы. Выберите Продолжить в отображении обзор белый в фоновом режиме и силы Атлас в layout ручку.
Затем выберите базовую пару PANTHER для анализа группы генов upregulation. Опухолевыесферы диаметром более 100 микрометров образуются в течение семи дней после культуры. Цитометрический анализ потока показывает увеличение экспрессии LGR5 и CD133 в опухолевыхсферах HT29 по сравнению с родительскими клетками HT29.
После секвенирования РНК гены с большим, чем одним изменением лог2 раза в их вверх или вниз по регуляции с P-значением менее 0,05, как это определено тепловой картой, могут быть построены, чтобы различать значительные гены между опухолевыми группами HT29 и родительскими клетками HT29. В этом репрезентативном эксперименте анализ регулируемых генов с более чем одной складкой журнала 2 привел к 10 генам семян, связывающим генные сети. Анализ базовой пары PANTHER показал, что два гена были связаны с отрицательной регуляцией апоптоза.
Кроме того, выбранные гены были, следовательно, подтверждены количественным ПЦР, подтверждающим их повышенную экспрессию в опухолевыхсферах HT29. Выбор дифференциальных генов является наиболее важным шагом процедур. Не забудьте использовать изменение раза журнала 2 больше, чем один с пересчетом более 100 в качестве критериев.
Используя этот протокол, гены, отобранные из колоректального производных опухолевыхсфер, могут быть сбиты или переэкспрессированы, чтобы раскрыть свою потенциальную роль в формировании опухолевой системы.
