우리의 프로토콜은 RNA-Seq 및 생체 포맷 도구를 사용하여 줄기와 같은 대장 종양스피어의 형성에 기여하는 과발현 운전자 유전자를 신속하게 발견했습니다. 이 프로토콜은 선택적 대장암에서 암 줄기를 위한 분자 메커니즘을 조사하기 위해 차별화적으로 발현된 유전자 및 신호 경로를 선별하는 데 사용됩니다. 문화의 7일째에, 디지털 세포 화상 진찰 시스템을 가진 반전된 현미경을 사용하여 종양권의 직경을 관찰하고 측정합니다.
종양권이 100 마이크로미터 직경보다 큰 도달하면 배양을 0.25%의 트립신으로 치료합니다. 섭씨 37도에서 5분 후, 트립신을 성장 배지의 2배의 부피로 중화시키고 혈종계를 사용하여 세포를 세어보세요. 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.
그리고 중간 농도의 100 마이크로리터 당 4개의 세포에 5회 10에서 펠릿을 재중단한다. 각 튜브에 관심있는 1 차 항체의 2 개의 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 30 분 동안 세포를 배양하고 분당 200 회전합니다. 인큐베이션의 끝에서, PBS의 900 마이크로리터로 각 튜브를 세척하고 표준 프로토콜에 따라 세포 측정을 유동하여 관심있는 단백질의 발현을 위해 세포를 분석한다.
트라이신 수집 후 RNA 절연을 위해, PBS 농도의 50 마이크로리터 당 50 마이크로리터 당 두 번 10에서 다섯 번째 세포로 세포를 다시 중단하고 튜브 당 베타 mercaptoethanol의 2 개의 마이크로 리터로 보충 된 용해 완충제 200 마이크로 리터로 각 샘플을 용액. 짧은 소용돌이와 실온에서 5 분 배양 후, 원심 분리에 의해 lysates를 수집하고 각 튜브에 70 %의 마이크로 리터 200 마이크로 리터를 추가합니다. 샘플을 빠른 컬럼으로 옮기고 원심분리로 용매를 제거합니다.
400 마이크로리터의 워시 용액 1개와 600 마이크로리터의 시료를 세척하여 원심분리에 의해 비RNA를 완전히 제거하고, 동일한 원심분리 조건하에서 2분 원심분리를 추가하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 그런 다음 체급물을 함유하는 RNA를 수집하기 전에 튜브 당 증류수 50 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고 샘플을 원심분리합니다. RNA 염기서열 분석 후 부모 종양 세포에 비해 종양권 세포 간의 차분 유전자 발현을 조사한다.
종양권 및 부모 그룹에서 100개 이상의 읽기 수를 가진 1~1개의 log2 접이식 변경을 뺀 유전자를 선택합니다. 그리고 표시된 대로 명령을 사용합니다. 데이터의 화산 플롯을 획득하여 차동 유전자 발현을 결정한다.
네트워크 분석가에서 의 구동 유전자 선택을 위해, 단일 유전자 입력을 선택하고 선택된 과발현 유전자를 인간과 함께 복사하고 붙여넣은 인간과 함께 유기체 및 공식 유전자 기호로서 ID 유형으로 지정한다. 업로드를 클릭하고 진행합니다. 단백질 단백질 상호 작용을 사용하여 데이터를 삽입하고 분석하려면 유전 단백질-단백질 상호 작용에 따라 900의 신뢰도 점수가 차단된 STRING 상호작용 데이터베이스를 사용하여 종자 유전자를 표시합니다.
업로드된 유전자를 교차 연결합니다. 더 개별적인 유전자와 연관되는 종자 유전자는 종양권의 형성을 유지하는 데 관여할 수 있는 드라이버 유전자로서 선택될 수 있다. 레이아웃 노브에서 배경 및 포스 아틀라스의 매핑 개요 흰색에서 진행을 선택합니다.
그런 다음 표범 염기 쌍을 선택하여 강화 조절 유전자 그룹을 분석합니다. 경배도 7일 이내에 직경이 100 마이크로미터 이상인 종양스피어. 유동 세포 측정 분석은 부모 HT29 세포에 비해 HT29 유래 종양스피어에서 LGR5 및 CD133 발현의 증가를 나타낸다.
RNA 시퀀싱 후, 열지도에 의해 결정된 바와 같이 0.05 미만의 P-값으로 1개 이상의 log2 접기 조절을 가진 유전자는 HT29 유래 종양스피어 와 부모 HT29 세포 사이의 중요한 유전자를 구별하도록 플롯될 수 있다. 이 대표적인 실험에서, 1개의 log2 배 보다 큰 위로 조절된 유전자의 분석은 유전자 네트워크를 교차 연결하는 10개의 종자 유전자귀착되었습니다. 팬더 기본 쌍 분석은 2개의 유전자가 세포멸증의 부정적인 규칙과 연관되었다는 것을 표시했습니다.
더욱이, 선택된 유전자는 HT29 유래 종양권에서 그들의 증가한 발현을 확인하는 정량적인 PCR에 의해 결과적으로 검증되었다. 차동 유전자 선택은 절차의 가장 중요한 단계입니다. 기준으로 100보다 큰 재검표를 가진 log2 접기 변경 을 사용해야 합니다.
이 프로토콜을 사용하여, 대장 유래 종양권에서 선택된 유전자는 종양권 형성에 있는 그들의 잠재적인 역할을 밝히기 위하여 쓰러지거나 과발현될 수 있습니다.
