Protokolümüz, kök benzeri kolorektal tümör kürelerin oluşumuna katkıda bulunan aşırı ifade edilmiş sürücü genlerini hızlı bir şekilde ortaya çıkarmak için RNA-Seq ve biyoinformatik araçlar dan yararlandı. Bu protokol, seçici kolorektal kanserlerde kanser sapı için moleküler bir mekanizmayı araştırmak için farklı olarak ifade edilmiş gen ve sinyal yollarını taramak için kullanılır. Kültürün yedinci gününde, tümör kürelerinin çapını gözlemlemek ve ölçmek için dijital hücre görüntüleme sistemine sahip ters bir mikroskop kullanın.
Tümör küreleri 100 mikrometreden büyük çapa ulaştığında kültürü %0.25 tripsin ile tedavi edin. 37 santigrat derecede beş dakika sonra, büyüme ortamının iki katı hacmi ile tripsin nötralize ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak. Santrifüj ile hücreleri toplayın.
Ve peleti beş kez 10'da dört hücreye kadar 100 mikrolitre orta konsantrasyonda yeniden askıya alın. Her tüp ilgi birincil antikor iki mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika ve dakikada 200 devrimleri için hücreleri kuluçka. Kuluçka sonunda, her tüpü 900 mikrolitre PBS ile yıkayın ve standart protokollere göre akış sitometrisi ile ilgi proteininin ekspresyonu için hücreleri analiz edin.
Az önce gösterildiği gibi tripsin toplama dan sonra RNA izolasyonu için, pbs konsantrasyonunun 50 mikrolitresi başına iki kez 10 ila beşinci hücrelerde hücreleri yeniden askıya alın ve her numuneyi tüp başına iki mikrolitre beta merkaptoethanol ile takviye edilmiş 200 mikrolitre lisis tamponu ile eşitlayın. Kısa girdap ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka sonra, santrifüj ile lysates toplamak ve her tüp% 70 etanol 200 mikrolitre ekleyin. Numuneleri hızlı kolonlar halinde aktarın ve santrifüj ile çözücünün çıkarın.
400 mikrolitre yıkama çözeltisi 1 ve 600 mikrolitre yıkama çözeltisi ile yıkayın iki tamamen santrifüj ile herhangi bir RNA olmayan kaldırmak için, herhangi bir kalıntı etanol kaldırmak için aynı santrifüj koşulları altında ek bir iki dakika santrifüj takip. Daha sonra tüp başına 50 mikrolitre distile su peletleri yeniden askıya alın ve süpernatants içeren RNA toplamadan önce bir dakika için örnek santrifüj. RNA dizianalizi sonrası ebeveyn tümör hücreleri ile karşılaştırıldığında tümör küre hücreleri arasındaki diferansiyel gen ekspresyonunu araştırmak.
Tümörsfer ve ebeveyn gruplarında 100'den büyük okuma sayıları ile eksi bir log2 kat değişim birden büyük olan genleri seçin. Ve belirtildiği gibi komutları kullanın. Diferansiyel gen ekspresyonunu belirlemek için verilerin bir yanardağ arsa elde etmek için.
Ağ analisti sürücü gen seçimi için, tek gen girişi seçin ve kopyalayın ve insan ile kopyala ve kimlik türü olarak organizma ve resmi gen sembolü olarak belirtilen yapıştırın. Yükle'yi tıklatın ve devam edin. Genetik protein-protein etkileşimini takiben protein-protein etkileşimini kullanarak verileri yerleştirmek ve analiz etmek için, seri genleri göstermek için 900'lük bir güven puanı yla STRING etkileşimom veritabanını kullanın.
Yüklenen genleri birbirine bağlayacak. Daha bireysel genlerle ilişki içinde olan tohum genleri, tümör kürenin oluşumunu sürdürmede rol oynayan sürücü genleri olarak seçilebilir. Arka Plan'daki haritagenel bakış beyaz'ında Devam et'i ve Düzen tonundaki Atlası Zor'u seçin.
Ardından, regülasyon gen grubunu analiz etmek için PANTHER baz çiftini seçin. 100 mikrometreden daha büyük tümör küreler kültürden sonraki yedi gün içinde oluşur. Akış sitometrik analizi, HT29 türetilmiş tümörkürelerde ebeveyn HT29 hücrelerine göre LGR5 ve CD133 ekspresyonunda artış olduğunu ortaya koymaktadır.
RNA diziliminden sonra, birden fazla log2 kat olan genler, ısı haritasıile belirlenen 0,05'ten daha az P değeri ile yukarı veya aşağı regülasyonlarında değişiklik yaparak HT29 kaynaklı tümör küreleri ile ebeveyn HT29 hücreleri arasındaki önemli genleri ayırt etmek için çizilebilir. Bu temsili deneyde, birden fazla log2 kat ile upregulated genlerin analizi 10 tohum genleri sonuçlandı, gen ağları çapraz bağlantı. PANTHER baz çifti analizi iki genin apoptozun negatif regülasyonu ile ilişkili olduğunu göstermiştir.
Ayrıca seçilen genler ht29 türetilmiş tümörkürelerde artan ekspresyonlarını doğrulayan kantitatif PCR ile doğrulandı. Diferansiyel gen seçimi prosedürlerin en önemli adımıdır. Bir log2 kat değişiklik ölçüt olarak 100'den büyük recounts ile birden büyük kullanmayı unutmayın.
Bu protokol kullanılarak kolorektal kaynaklı tümör kürelerinden seçilen genler, tümörküre oluşumundaki potansiyel rollerini ortaya çıkarmak için yıkılabilir veya aşırı ifade edilebilir.
