Unser Protokoll nutzte RNA-Seq und bioinformatische Werkzeuge, um schnell die überexprimierten Treibergene aufzudecken, die zur Bildung von stammartigen kolorektalen Tumorsphären beitragen. Dieses Protokoll wird verwendet, um ein differenziell exprimiertes Gen und Signalwege zu untersuchen, um einen molekularen Mechanismus für Krebsstammbeifälle bei selektiven Dickdarmkrebszuverfahren zu untersuchen. Verwenden Sie am siebten Tag der Kultur ein invertiertes Mikroskop mit einem digitalen Zellbildsystem, um den Durchmesser der Tumorsphären zu beobachten und zu messen.
Wenn die Tumorsphären einen Durchmesser von mehr als 100 Mikrometern erreichen, behandeln Sie die Kultur mit 0,25% Trypsin. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, neutralisieren Sie das Trypsin mit dem zweifachen Volumen des Wachstumsmediums und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Und setzen Sie das Pellet fünfmal 10 bis zu den vier Zellen pro 100 Mikroliter mittlerer Konzentration aus. Fügen Sie zwei Mikroliter des primären Antikörpers von Interesse zu jeder Röhre und inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur und 200 Umdrehungen pro Minute. Am Ende der Inkubation, waschen Sie jedes Rohr mit 900 Mikroliter PBS und analysieren Sie die Zellen für die Expression des Proteins von Interesse durch Durchflusszytometrie nach Standardprotokollen.
Für die RNA-Isolierung nach der soeben nachgewiesenen Trypsin-Sammlung setzen Sie die Zellen bei zwei mal 10 bis fünf Zellen pro 50 Mikroliter PBS-Konzentration wieder aus und lyse jede Probe mit 200 Mikroliter Lysepuffer, ergänzt mit zwei MikroliterBeta-Mercaptoethanol pro Tube. Nach kurzer Wirbelung und einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Lysate durch Zentrifugation sammeln und 200 Mikroliter 70% Ethanol in jede Röhre geben. Die Proben in schnelle Spalten übertragen und das Lösungsmittel durch Zentrifugation entfernen.
Waschen Sie die Proben mit 400 Mikroliter waschlösung eins und 600 Mikroliter Waschlösung zwei, um jede Nicht-RNA durch Zentrifugation vollständig zu entfernen, gefolgt von einer zusätzlichen zentrifugierenden Zentrifugation von zwei Minuten unter den gleichen Zentrifugenbedingungen, um Restethanol zu entfernen. Dann setzen Sie die Pellets in 50 Mikroliter destilliertem Wasser pro Tube wieder auf und zentrifugieren Sie die Probe für eine Minute, bevor Sie die RNA mit Überdrinzien sammeln. Es sollte die Differenzgenexpression zwischen Tumorsphärenzellen im Vergleich zu elterlichen Tumorzellen nach der RNA-Sequenzierungsanalyse untersucht werden.
Wählen Sie Gene mit einer Anzahl von mehr als einem bis minus einem Log2-Falzwechsel mit Lesezahlen größer als 100 in der Tumorsphäre und Elterngruppen aus. Und verwenden Sie die Befehle wie angegeben. Um ein Vulkandiagramm der Daten zu erhalten, um die Differentialgenexpression zu bestimmen.
Für die Antriebsgenauswahl im Netzwerkanalytiker wählen Sie einzelne Geneingaben aus und kopieren und fügen Sie die ausgewählten überexprimtiven Gene mit dem Menschen ein, der als Organismus und offizielles Gensymbol als ID-Typ angegeben ist. Klicken Sie auf Hochladen und fortfahren Sie. Um die Daten mithilfe der Protein-Protein-Interaktion nach genetischer Protein-Protein-Interaktion einzufügen und zu analysieren, verwenden Sie die STRING-Interactome-Datenbank mit einem Konfidenzwert von 900, um die Samengene zu zeigen.
Vernetzung der hochgeladenen Gene. Die Samengene, die mit mehr einzelindividuellen Genen assoziiert sind, können als Treibergene ausgewählt werden, die an der Aufrechterhaltung der Bildung der Tumorsphäre beteiligt sein können. Wählen Sie In der Mapping-Übersicht weiß im Hintergrund- und Force Atlas im Layout-Regler die Option Fortfahren aus.
Wählen Sie dann das PANTHER-Basispaar aus, um die Upregulation-Gengruppe zu analysieren. Tumorsphären von mehr als 100 Mikrometern Durchmesser bilden sich innerhalb von sieben Tagen kultur. Die zytometrische Analyse des Flusses zeigt eine Zunahme der LGR5- und CD133-Expression in HT29-abgeleiteten Tumorsphären im Vergleich zu elterlichen HT29-Zellen.
Nach der RNA-Sequenzierung können die Gene mit einer mehr als ein log2-Falte-Änderung in ihrer Auf- oder Abwärtsregulation mit einem P-Wert kleiner als 0,05, wie durch Wärmekarte bestimmt, dargestellt werden, um die signifikanten Gene zwischen HT29-abgeleiteten Tumorsphären und elterlichen HT29-Zellen zu unterscheiden. In diesem repräsentativen Experiment führte die Analyse der hochregulierten Gene mit einem mehr als einem Log2-Fachbestand zu 10 Samengenen, die die Gennetzwerke miteinander vernetzen. Die Panther-Basispaaranalyse zeigte, dass zwei Gene mit einer negativen Regulation der Apoptose in Verbindung gebracht wurden.
Darüber hinaus wurden die ausgewählten Gene folglich durch quantitative PCR validiert, die ihre erhöhte Expression in HT29-abgeleiteten Tumorsphären bestätigten. Die Differenzgenauswahl ist der wichtigste Schritt der Verfahren. Denken Sie daran, eine log2-Faltänderung zu verwenden, die größer als eine mit Neuzählungen größer als 100 als Kriterien ist.
Mit diesem Protokoll können die Gene, die aus den kolorektal abgeleiteten Tumorsphären ausgewählt wurden, niedergeschlagen oder überexprimiert werden, um ihre potenziellen Rollen bei der Tumorsphärenbildung aufzudecken.
