Este protocolo proporciona una lesión precisa y controlada quirúrgicamente para inducir una transección completa de la médula espinal en ratones con una alta reproducibilidad y tasas de supervivencia muy altas. El uso de un taladro fino para la lesión ósea minimiza el daño al tejido circundante, permitiendo que las respuestas de la lesión y el tratamiento se modelen con mayor precisión. Para realizar una laminectomía, después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal en una hembra anestesada de ocho a 10 semanas de edad C57 negro 6 ratón, afeitar la piel de la espalda para exponer el área quirúrgica sobre la columna dorsal y esterilizar la zona afeitada con hisopos de algodón estéril empapados en povidona yodo antiséptico líquido y espíritu quirúrgico.
Usando un bisturí, haz una incisión vertical de línea media a nivel vertebral T10 y usa fórceps rectos para levantar la piel de la fascia subyacente para facilitar la colocación del retractor. Para exponer las espinas de las vértebras T9 a T11, utilice el borde romo del bisturí para hacer una pequeña incisión de línea media en el tejido subcutáneo y fascia subyacente y utilice fórceps no afilados de punta fina para difundirse y reflejar la fascia. Para exponer las láminas, utilice la punta contundente del bisturí para dividir el tronco dorsal y los músculos paraspinos a lo largo de las espinas del T9 a través de las vértebras T11 y utilice los fórceps finos contundentes para diseccionar los músculos de las capas para exponer las láminas de las vértebras.
Utilice los mismos fórceps para hacer pequeños bolsillos alrededor de los procesos transversales de la vértebra T10 y enganchar las puntas de los fórceps curvos bajo los procesos transversales dentro de los bolsillos creados para estabilizar el cuerpo vertebral T10. Enjuague bien las láminas T10 con solución salina tibia y use hisopos de algodón para limpiar suavemente la superficie ósea, teniendo cuidado de que no queden accesorios musculares o ligamentos a lo largo de la superficie bilateral. Para romper las láminas bilateralmente, utilice una punta de broca de siete milímetros de diámetro y siete milímetros de longitud para trazar un camino vertical desde el espacio intervertebral T9/T10 hasta el espacio intervertebral T10/T11 a lo largo de ambos laminados T10 con el taladro apagado.
Cuando el camino haya sido trazado, encienda el taladro y haga lentamente y cuidadosamente una zanja vertical en la lámina derecha de la vértebra T10, utilizando los fórceps curvos para mantener la vértebra estable. Después de repetir el proceso en el lado izquierdo de la lámina, irrigar el tejido con solución salina tibia para lavar los fragmentos óseos restantes. Mantener un buen agarre en la columna vertebral con una mano es esencial para este paso.
También es importante sentirse cómodo y seguro con el uso del taladro. A continuación, utilice los fórceps de punta fina en ángulo para agarrar el proceso espinoso y eliminar todo el segmento dorsal de las láminas separados por la perforación bilateral. Luego, irrigar y hisopo según sea necesario para permitir una visualización clara de la médula espinal dentro de la ventana de laminectomía.
Para inducir la lesión de la médula espinal dentro de la cuerda expuesta, utilice una cuchilla estrecha y redonda con filo para cortar la cuerda en el centro de la ventana de laminectomía, teniendo cuidado de barrer los huecos laterales de la columna vertebral para inducir una lesión de transección completa. Para confirmar la integridad de la lesión por transección, utilice los fórceps de punta fina contundentes para eliminar las conexiones restantes en el sitio de transección. Una vez que se ha logrado la hemostasia en el sitio de la transección, suelte el agarre del forcep curvo en la vértebra T10 y reúna los bordes de los músculos diseccionados a lo largo de la línea media para lograr una buena aposición.
Usando 5/0 poliglactin 910 suturas absorbibles, suturar los músculos en capas, asegurándose de que la curvatura natural de la columna vertebral no causa ninguna tensión en la línea de sutura o abrir las suturas. Luego, utilice suturas de seda no absorbibles 5/0 para cerrar el tejido subcutáneo y la piel, teniendo cuidado de que no haya sangrado, coágulos o restos que queden debajo de la piel antes del cierre. Para evaluar si este método para inducir la lesión de la médula espinal de tipo transección en ratones es reproducible y consistente, la médula espinal lesionada se puede analizar mediante inmunohistoquímica y se pueden realizar pruebas conductuales en los ratones.
El inmunoetiquedo contra el marcador de astrocitos, proteína ácida fibribrillaria glial, facilita la demarcación del límite de la médula espinal intacta. En esta sección longitudinal, el lugar de la lesión situado se puede visualizar entre los tocones del cordón como se esperaba. Un defecto de tamaño consistente se puede inducir en el sitio de transección con una distancia mínima media de 550,4, más o menos 17,3 micrómetros.
Los datos conductuales que despliegan la escala de ratón Basso de una prueba de campo abierto muestran que los ratones lesionados no presentan ningún movimiento de las extremidades posteriores después de la lesión. Por lo tanto, el protocolo produce una lesión completa y fiable del tipo de transección que resulta en una pérdida completa de la función por debajo del nivel de lesión que no conduce a la reversión espontánea de la parálisis. Tenga cuidado de perforar en línea recta con una mano estable, ya que puede ser muy difícil reparar la ventana de laminectomía una vez que se ha perforado incorrectamente.
Después de la inducción de la lesión de la médula espinal, se pueden aplicar varias opciones de tratamiento, como la administración de medicamentos y el trasplante celular para identificar posibles terapias que mejoren la recuperación de lesiones de la médula espinal.
