Queremos crear un modelo de accidente cerebrovascular que produzca un coágulo de sangre que sea similar a las muestras de pacientes y que responda a la terapia trombolítica clínicamente relevante. Por lo tanto, modificamos el modelo clásico de ictus fototrombótico y mezclamos trombina y el colorante fotodinámico rosa de bengala antes de la fotoactivación. Nos complace que este procedimiento cree coágulos sanguíneos que son altamente sensibles a la trombólisis mediada por tPA.
Este modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico modificado utiliza procedimientos quirúrgicos muy simples con una baja tasa de mortalidad que produce un tamaño y una ubicación del infarto altamente consistentes. También se produce un coágulo de sangre mixto de fibrina y plaquetas que es similar a los del paciente con accidente cerebrovascular agudo. Por lo tanto, creemos que es muy útil para la investigación preclínica del ictus desarrollar terapias trombolíticas más eficaces.
Esperamos que más personas usen nuestro modelo. La demostración del procedimiento estará a cargo del Dr. Yu-Yo Sun, nuestro profesor asistente de investigación en nuestro grupo. 30 minutos antes de la cirugía, prepare al ratón inyectando un analgésico.
Después de anestesiar al ratón, realice un pellizco en el dedo del pie para asegurarse de que esté completamente anestesiado. A continuación, retira el vello de la parte izquierda del cuello y la cabeza con crema depilatoria. Coloque el ratón en el adaptador para animales pequeños en posición supina y esterilice el área de la piel quirúrgica limpiándola con tres pasadas alternas de povidona yodada y etanol al 70%.
Bajo un microscopio de disección, haga una incisión cervical izquierda de 0,5 centímetros con un par de microtijeras y pinzas rectas a unos 0,2 centímetros laterales a la línea media. A continuación, con un par de pinzas dentadas finas, separe el tejido blando y la fascia para exponer el LCCA. Luego, con un par de pinzas finas y lisas, separe cuidadosamente el LCCA del nervio vago.
Coloque una sutura permanente de doble nudo alrededor del LCCA con una sutura de seda 5-0. Coloque el mouse en una posición prona y gire el rodillo de pinza nasal 15 grados. A continuación, esterilice la zona quirúrgica limpiando la piel con tres pasadas alternas de Betadine y etanol al 70%.
Haga una incisión de 0,8 centímetros en el cuero cabelludo con un par de microtijeras y pinzas rectas a lo largo del ojo y la oreja izquierdos para exponer el músculo temporal. A continuación, haga una incisión de 0,5 centímetros a lo largo del borde del músculo temporal en el hueso parietal izquierdo. A continuación, haga una segunda incisión vertical de 0,3 centímetros en el músculo temporal y retraiga el músculo para exponer el borde del hueso parietal y el hueso escamoso.
Asegúrese de visualizar el punto de referencia de la sutura coronal entre los huesos frontal y parietal. A continuación, humedezca el cráneo aplicando solución salina estéril para revelar el MCA izquierdo y marque la rama proximal del MCA en el hueso escamoso con un marcador. Dibuja suavemente un círculo de un milímetro de diámetro alrededor de esta área marcada con un taladro dental neumático.
A continuación, adelgaza el cráneo a unos 0,2 milímetros de profundidad sin tocar la duramadre inferior. Detenga la perforación cuando quede una capa muy delgada de hueso. A continuación, mezcle la solución de trombina y rosa de bengala en función del peso corporal del ratón e inyecte lentamente la mezcla en el seno retroorbitario con una aguja de calibre 31.
Aplique ungüento para los ojos en ambos ojos para prevenir la sequedad. Aplique el iluminador con una luz láser de 532 nanómetros en el sitio perforado dentro de una distancia de dos pulgadas durante 20 minutos. Visualice la iluminación en la rama proximal del MCA a través de gafas de proyección láser.
Después de 20 minutos, detenga la iluminación láser. Haz una ventana craneal de tres milímetros de diámetro en el hueso parietal del cráneo, y coloca un cubreobjetos sobre ella. A continuación, ubique el ACM distal bajo una lente de objetivo de inmersión en agua de 20x.
Marque la plaqueta circulante mediante la inyección en la vena de cola del anticuerpo conjugado anti-GP1b-beta conjugado DyLight 488 cinco minutos antes de la toma de imágenes. A continuación, inyecte retroorbitalmente la mezcla de solución de trombina y rosa de bengala. Fotoactive el MCA utilizando un sistema láser de 532 nanómetros con un rayo láser de 10 micrómetros de diámetro y grabe la imagen hasta la formación de trombos.
Para la administración de tPA, coloque al animal anestesiado sobre una almohadilla tibia a 37 grados centígrados. Envuelva su cola con una gasa húmeda tibia a 45 grados centígrados durante un minuto en el punto de tiempo posterior a la fotoactivación seleccionado. A continuación, inyecte el tPA humano recombinante a través de la vena de la cola.
Inyectar el 50% en forma de bolo e infundir el 50% restante durante 30 minutos con una bomba de infusión. Para controlar el flujo sanguíneo cerebral, haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo con el cráneo expuesto. Hidrata el cráneo con solución salina estéril y aplica suavemente el gel de ultrasonido sobre él, asegurándote de evitar el pelo o las burbujas de aire en el gel.
Controle el flujo sanguíneo cerebral en ambos hemisferios cerebrales bajo el generador de imágenes de contraste de manchas láser durante 10 minutos. El marcaje de inmunofluorescencia muestra que en la fototrombosis basada en el colorante de rosa de bengala, la rama de MCA estaba densamente repleta de plaquetas CD41 positivas y poca fibrina. Por el contrario, en la fototrombosis de trombina más rosa de bengala, la rama de MCA estaba ocluida por coágulos de plaquetas y fibrina mezclados al azar.
El análisis de inmunotransferencia mostró un aumento de más del doble en el depósito de fibrina en el hemisferio ipsilateral en la fototrombosis de trombina más rosa de bengala en comparación con la rosa de bengala sola. Las imágenes intravitales basadas en microscopio confocal mostraron que una inyección intravenosa de trombina no logró inducir agregados plaquetarios, incluso bajo iluminación láser. Las plaquetas formaron coágulos homogéneos en el modelo de fototrombosis de la rosa de bengala, pero agregados desiguales con múltiples regiones débiles en el modelo de trombina más rosa de bengala.
El CBF del mismo ratón antes y 24 horas después del tPA en comparación con el tratamiento con vehículo se midió mediante imágenes de contraste de moteado láser y se normalizó al hemisferio contralateral. En la fototrombosis de la rosa de bengala, el tratamiento con tPA condujo a una tendencia de recuperación del CBF, particularmente en el área del borde isquémico en comparación con los ratones tratados con vehículos. En la fototrombosis de trombina más rosa de bengala, la recuperación de CBF en ratones tratados con tPA fue más prominente, y las ramas proximales de MCA a menudo se hicieron visibles a las 24 horas.
En la fototrombosis de la rosa de bengala, se detectó un tamaño de infarto similar en ratones tratados con vehículo y tratados con tPA. Por el contrario, en la fototrombosis de trombina más rosa de bengala, el tratamiento lítico con tPA redujo significativamente el infarto a las 0,5, una o dos horas, pero no a las seis horas posteriores a la fotoactivación en comparación con los ratones tratados con el vehículo. Este método se puede utilizar para investigar la composición del coágulo y para estudiar más a fondo los tratamientos trombolíticos.
Después de este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos de terapia de trombólisis y determinar la eficacia posterior. La adición de trombina permite ajustar la composición del coágulo de pobre en fibrina a rica en fibrina, lo que permite a los investigadores desarrollar estrategias terapéuticas clínicamente relevantes.
