General: Los autores quieren agradecer a los investigadores del Proyecto de Medicina de Precisión Renal (www.kpmp.org) por su amable apoyo y asesoramiento.
Financiación: El soporte para este trabajo fue proporcionado por el NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). La investigación reportada en este manuscrito fue apoyada por el Proyecto de Medicina de Precisión Renal (KPMP) del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), (www.kpmp.org), bajo el número de premio U2CDK114886.
Disponibilidad de datos y materiales: Los datos se archivan en el Ómnibus de expresión génica (GEO # pendiente)

El estudio fue aprobado para su uso por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Indiana.
NOTA: Utilice este protocolo con tejido de nefrectomía renal (hasta 2 cm en las dimensiones X e Y) conservado en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y almacenado a -80 °C. Realice todo el trabajo de una manera que limite la contaminación por ARN, use guantes desechables limpios y una máscara facial. Asegúrese de la limpieza de todas las superficies. El equipo para el que se optimizó este protocolo es un sistema de microdisección láser con láser UV pulsado.
1. Criosección
<ol><li>Exponer 1,2 μm LMD PPS-membrana (poli(sulfuro de fenileno) se desliza a la luz UV (en una campana de flujo laminar de cultivo de tejido) durante 30 minutos, inmediatamente antes de la criosección. Guarde las diapositivas a temperatura ambiente para una adherencia óptima del tejido.</li>
	<li>Enfríe el criostato a -20 °C. Limpie las superficies de trabajo e instale una nueva hoja de corte.</li>
	<li>Coloque una pequeña caja deslizante (limpiada con solución de descontaminación superficial RNase) dentro de la cámara criostato para almacenar diapositivas con tejido recién cortado.</li>
	<li>Adhiera la muestra en OCT a un soporte de tejido y deje que se equilible durante unos minutos para alcanzar la temperatura de la cámara y fortalecer la adherencia entre el bloque OCT y el soporte. Ayudar al proceso mediante el uso de un extractor de calor.</li>
	<li>Corte la muestra a un espesor de 12 μm y colótela en la diapositiva LMD especializada, utilizando el adaptador de diapositivas. Cada diapositiva contiene una sección de nefrectomía por diapositiva o hasta dos secciones de biopsia renal por diapositiva. Guarde las diapositivas a -80 °C con un cartucho desecante y dentro de una bolsa de plástico bien cerrada para evitar que el exceso de humedad se acumule dentro de la caja deslizante.</li>
	<li>Etiquete cada diapositiva con un ID de muestra, fecha y número de diapositiva.</li>
	<li>Utilice las diapositivas con muestras dentro de los 10 días a partir de la fecha inicial de criosección.</li>
</ol>2. Microdisección láser
<ol><li>Inmediatamente antes de la tinción, prepare la Mezcla de Anticuerpos (Ab-Mix) en 10% BSA en RNase-free PBS añadiendo lo siguiente: 4 μL de FITC-Phalloidin, 1,5 μL de DAPI, 2 μL de anticuerpo tamm-horsfall protein (THP) conjugado directamente a Alexa Fluor 546, 3,3 μL de inhibidor de la anasa y 89,2 μL del 10% de BSA en PBS (para alcanzar un volumen de 100 μL). NOTA: Se pueden utilizar anticuerpos alternativos en lugar del anticuerpo THP. Por ejemplo, 2 μL de anticuerpo megalíndrico/LRP2, directamente conjugado a Alexa Fluor 568, se pueden utilizar para etiquetar el tubérculo proximal. El Ab-Mix contiene anticuerpo LRP2 o THP (para visualizar tubulos proximales o extremidades ascendentes gruesas, respectivamente). Otros anticuerpos pueden ser validados de acuerdo con las necesidades del usuario.</li>
	<li>Lave el tobogán en frío helado (-20 °C) 100% acetona durante 1 min y muévalo a la cámara de humedad.</li>
	<li>Lave la parte superior de la diapositiva con RNase-free PBS durante 30 s. Repita.</li>
	<li>Lave la parte superior de la diapositiva con un 10% de BSA en RNase-free PBS durante 30 s. Repita.</li>
	<li>Aplique ab-mix durante 5 minutos.</li>
	<li>Lave la parte superior de la diapositiva con un 10% de BSA en RNase-free PBS durante 30 s. Repita.</li>
	<li>Seque al aire el tobogán durante 5 minutos y cárguelo en la plataforma de corte por microdisección láser.</li>
	<li>Instale los tubos de recogida (tubos de microcentrífuga autoclavados de 0,5 ml) adecuados para el trabajo de PCR, que contienen 50 μL de tampón de extracción del kit de aislamiento de ARN.</li>
	<li>Proceda con LMD. Complete cada sesión LMD en un plazo máximo de 2 horas.<ol>
<li>Recoger imágenes de inmunofluorescencia pre y post-LMD, utilizando la cámara del microscopio para validar la disección para la variabilidad entre operadores, así como fines de archivo, formación y evaluación de calidad del protocolo realizado. Para obtener 0,5 – 1 ng de ARN, se requiere un mínimo de 500.000 μm2 de área. Esto a menudo requiere el uso de hasta 8 secciones de hasta 8 x12 μm de espesor para obtener una cantidad suficiente de material para todos los subsegmentos de interés.</li>
		<li>Identifique las regiones de interés manchando, morfología y ubicación e incidarlas utilizando potencia láser superior a 40. NOTA: Estos son los criterios de disección. El tubérculo proximal se define mediante el etiquetado FITC-Phalloidin y LRP2. La extremidad ascendente gruesa se define mediante el etiquetado THP. El conducto de recogida se define por morfología nuclear (DAPI) y ausencia de otras manchas. El glomérculo se define por FITC-Phalloidin y morfología. El intersticio se define como el área entre tubulos manchados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Obtenga una firma de expresión transversal masiva colocando dos secciones de 12 μm en una diapositiva LMD y diseccionando todas las secciones en el búfer de extracción.</li>
	<li>Una vez finalizado el proceso LMD, cierre los tubos de microcentrífuga de recogida y deslícelo vigorosamente para asegurarse de que el contenido se moviera de la tapa a la parte inferior del tubo</li>
	<li>Centrífuga los tubos a 3.000 x g durante 30 s.</li>
	<li>Incubar los tubos en un baño de agua a 42 °C durante 30 min.</li>
	<li>Centrífuga los tubos a 3.000 x g durante 2 minutos.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 0,5 ml y guárdelo en -80 °C.</li>
</ol>3. Aislamiento de ARN
NOTA: Para este protocolo de aislamiento de ARN, hemos adaptado un protocolo de un kit comercial de aislamiento de ARN. El protocolo del fabricante se ha modificado para cumplir con los requisitos de control de calidad establecidos para el proyecto.
<ol><li>Añadir 250 μL de amortiguador condicionado (CB) a cada columna de purificación de ARN (PC) e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrífuga todos los PC durante 1 min a 16.000 x g.</li>
	<li>Agregue 50 μL de etanol al 70% (proporcionado en el Kit) en los tubos con muestras de tejido. Mezcle bien las muestras pipeteando hacia arriba y hacia abajo. No vórtice. No centrífugas.</li>
	<li>Transferir la mezcla a PC acondicionados y centrífuga durante 2 minutos a 100 x g (para unir ARN), siga rápidamente con centrifugación durante 30 s a 16.000 x g (para eliminar el flujo a través). Repita este paso si hay más de 1 tubo con muestras de tejido disponibles para cualquier subsegmento dado.</li>
	<li>Añadir 100 μL de wash buffer 1 (WB1) en los PC y centrífuga durante 1 minuto a 8.000 x g.</li>
	<li>Preparar 40 μL de DNase por cada muestra (Añadir 5 μL de DNase a 35 μL de búfer RDD). A continuación, añadir 40 μL de la mezcla directamente en la membrana del PC e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 40 μL de WB1 en la membrana de PC, y centrífuga para 15 s a 8.000 x g.</li>
	<li>Añadir 100 μL de wash buffer 2 (WB2) en la membrana de PC, y centrífuga durante 1 min a 8.000 x g.</li>
	<li>Añadir 100 μL de WB2 en la membrana de PC, centrífuga durante 2 min a 16.000 x g,seguido inmediatamente por centrifugación durante 1 min a 16.000 x g.</li>
	<li>Transfiera el PC a un nuevo tubo de 0,5 ml.</li>
	<li>Añadir 12 μL de Elution Buffer (EB) en la membrana e incubar durante 7 min a temperatura ambiente. Por lo tanto, el volumen final de todas las muestras de tejido diseccionado agrupadas es de 12 μL por subsegmento.</li>
	<li>Centrífuga las muestras durante 1 min a 1.000 x g y luego durante 2 min a 16.000 x g.</li>
	<li>Transfiera 2 μL a un tubo fresco para el análisis de Bioanalyzer (para prevenir eventos de congelación y descongelación).</li>
	<li>Almacene todos los tubos a -80 °C hasta que estén listos para su posterior procesamiento.</li>
</ol>4. Secuenciación de ARN
<ol><li>Evaluar cada muestra, destinada a la secuenciación, para la calidad utilizando un Bioanalyzer comercial y un chip dedicado a medir pequeñas cantidades de ARN.</li>
	<li>Se requieren siguientes parámetros de control de calidad (QC) antes de la preparación y secuenciación de la biblioteca: Cantidad de ARN superior a 4 ng para granel y superior a 0,5 – 1 ng para cada subsegmento; El porcentaje de transcripciones superiores a 200 nucleótidos (DV200) debe ser superior al 25% para las muestras lmd (óptimo > 75%).</li>
	<li>Lleve a cabo la preparación de la biblioteca con un kit comercial de preparación de la biblioteca cDNA destinado a pequeñas cantidades de ARN degradado. Para el kit comercial enumerado en el suplemento, sugerimos el uso de la opción 2, que requiere un DV200 mínimo del 25% y ninguna fragmentación. Algunas tecnologías de secuenciación pueden requerir umbrales mínimos de DV200 más altos, como 30%7.</li>
	<li>Agregue adaptadores e índices cDNA.</li>
	<li>Purifique las bibliotecas RNAseq utilizando tecnología de cuentas magnéticas.</li>
	<li>Agote el cDNA ribosomal utilizando un kit comercial de eliminación de ARN antes del paso de amplificación de la biblioteca RNAseq.</li>
	<li>Purifique la biblioteca RNAseq final utilizando tecnología de cuentas magnéticas a una concentración de biblioteca cDNA de 2 ng/μL.</li>
	<li>Lleve a cabo la secuenciación de ARN de 75 bp de extremo emparejado en un sistema de secuenciación comercial con 30 millones de lecturas/muestra para granel y 100 millones de lecturas/muestra para secciones subsegcionales.</li>
	<li>Utilice un ARN de referencia (25 μg) con cada ejecución de secuenciación para permitir el control del efecto de lote. La concentración inicial de nuestro ARN de referencia es de 1 μg/μL, mientras que la concentración final utilizada en la secuenciación es de 25 ng/μL.</li>
	<li>Realizar análisis de datos utilizando la aplicación FastQC para evaluar la calidad de las lecturas secuenciatorias, intergénicas y mitocondriales y para determinar las lecturas atribuidas a un gen.</li>
	<li>Utilice el Visor de genómica integrativa (IGV) para la alineación y edgeR/rbamtools para las medidas de expresión de transcripción.</li>
	<li>Retire muestras con menos de 100.000 lecturas. Quantile normaliza las lecturas sin procesar en el conjunto de datos después de filtrar genes expresados humildemente en un umbral definido por el usuario.</li>
	<li>Cuantifique la expresión como una relación del subsegmento de interés con respecto al promedio de todos los demás subsegmentos y log2-transform. La expresión relativa del mismo gen puede compararse entre subsegmentos y muestras; sin embargo, no es ideal comparar la expresión relativa entre dos genes diferentes debido a posibles diferencias en la degradación entre los genes y las especies de ARN.</li>
	<li>Realice un análisis de enriquecimiento para comparar la expresión génica de un conjunto de fabricantes específicos de cada subsegmento de nefrón, mientras que las muestras de ARN de referencia se comparan entre lotes. Un efecto de lote dentro de 1 desviación estándar de expresión media con valor R > 0.9 se considera aceptable. Se requiere una normalización adicional para una puntuación de efecto por lotes más alta. Cualquier ejecución que se desvíe del efecto de lote aceptado se puede marcar. El Q30 debe ser mayor que >90% para cada ejecución de secuenciación.</li>
</ol>

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La transcriptómica basada en LMD es una tecnología útil que ancla la expresión génica a áreas específicas dentro del tejido. La base de esta tecnología y su aplicación potencial en el riñón se ha descrito anteriormente8. Sin embargo, la optimización, modernización y racionalización de la disección basada en la fluorescencia específicamente dirigida a la disección de alta precisión para la secuenciación de ARN aguas abajo es menos omnipresente. Debido a que esta metodología est?...

Los avances tecnológicos en el estudio de muestras de tejidos han mejorado la comprensión del estado de salud y enfermedades en varios órganos. Estos avances han puesto de relieve que la patología puede comenzar en regiones limitadas o en tipos celulares específicos, pero tienen implicaciones importantes en todo el órgano. Por lo tanto, en la era actual de la medicina personalizada, es importante entender la biología tanto a nivel celular como regional y no sólo a nivel mundial1. Esto es particularmente cierto en el riñón, que se compone de varias células especializadas y estructuras que inician y/o responden diferencialmente al estrés patológico. La patogénesis de varios tipos de enfermedad renal humana todavía no se entiende bien. Generar una metodología para estudiar los cambios en la expresión génica en segmentos tubulares específicos, estructuras o áreas del interstitium en el riñón humano mejorará la capacidad de descubrir cambios específicos de la región que podrían informar sobre la patogénesis de la enfermedad.
Los especímenes de biopsia renal humana son un recurso limitado y precioso. Por lo tanto, las tecnologías que interrogan la transcriptómica en el tejido renal deben optimizarse para economizar el tejido. Los métodos disponibles para estudiar la transcriptómica a nivel celular y regional incluyen secuenciación de ARN de una sola célula (scRNaseq), RNaseq nuclear único (snRNaseq), hibridación espacial in situ y microdissección láser (LMD). Este último es adecuado para el aislamiento preciso de regiones o estructuras de interés dentro de las secciones de tejido, para secuenciación y análisis de ARN aguas abajo2,3,4,5. La LMD se puede adoptar para basarse en la identificación de tipos o estructuras celulares específicas basadas en marcadores validados utilizando imágenes basadas en fluorescencia durante la disección.
Las características únicas de la transcriptómica regional asistida por microdisección láser incluyen: 1) la preservación del contexto espacial de las células y estructuras, que complementa las tecnologías unicelulares donde las células se identifican por expresión en lugar de histológicamente; 2) la tecnología informa y es informada por otras tecnologías de imágenes porque un marcador de anticuerpos define firmas de expresión; 3) la capacidad de identificar estructuras incluso cuando los marcadores cambian en la enfermedad; 4) detección de transcripciones poco expresadas en aproximadamente 20.000 genes; y 5) notable economía de tejidos. La tecnología es escalable a una biopsia renal con menos de 100 μm de espesor de un núcleo necesario para la adquisición suficiente de ARN y permite el uso de tejido congelado archivado, que comúnmente están disponibles en grandes repositorios o centros académicos6.
En el trabajo subsiguiente, describimos la tecnología de transcriptómica regional y a granel en detalle, optimizada con un nuevo protocolo de tinción rápida de fluorescencia para su uso con tejido renal humano. Este enfoque mejora las exploraciones lmd clásicas porque proporciona datos de expresión independientes para los subsegmentos de interstitium y nefrón en lugar de la expresión tubulointersticial agregada. Se incluyen las medidas de control y garantía de calidad implementadas para garantizar el rigor y la reproducibilidad. El protocolo permite la visualización de células y regiones de interés, lo que resulta en la adquisición satisfactoria de ARN de estas áreas aisladas para permitir la secuenciación de ARN aguas abajo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

El análisis de la expresión génica del tejido renal humano es una herramienta importante para entender la homeostasis y la fisiopatología de la enfermedad. Se necesita aumentar la resolución y profundidad de esta tecnología y extenderla al nivel de las células dentro del tejido. Aunque el uso de secuenciación única de ARN nuclear y unicelular se ha generalizado, las firmas de expresión de las células obtenidas de la disociación tisular no mantienen el contexto espacial. La microdisección láser (LMD) basada en marcadores fluorescentes específicos permitiría el aislamiento de estructuras específicas y grupos celulares de interés con localización conocida, permitiendo así la adquisición de firmas transcriptómicas ancladas espacialmente en el tejido renal. Hemos optimizado una metodología LMD, guiada por una mancha rápida a base de fluorescencia, para aislar cinco compartimentos distintos dentro del riñón humano y llevar a cabo la posterior secuenciación de ARN de valiosas muestras de tejido renal humano. También presentamos parámetros de control de calidad para permitir la evaluación de la adecuación de los especímenes recogidos. El flujo de trabajo descrito en este manuscrito muestra la viabilidad de este enfoque para aislar firmas transcriptómicas sub-segmentales con alta confianza. El enfoque metodológico que se presenta aquí también puede aplicarse a otros tipos de tejidos con la sustitución de marcadores de anticuerpos relevantes.

Muestras
Presentamos datos de nueve nefrectomías de referencia (3 muestras obtenidas en la Universidad de Indiana y 6 muestras obtenidas a través de Kidney Precision Medicine Project), utilizando el protocolo de tinción rápida de fluorescencia para aislar segmentos de nefrones renales y áreas intersticiales. Las secciones utilizadas en este proceso se obtuvieron de donantes renales fallecidos o nefrectomías tumorales no afectadas. Estas muestras no tenían evidencia pato...

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Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Describimos un protocolo para la microdisección láser de subsegmentos del riñón humano, incluyendo el glomérulo, tubérculo proximal, extremidad ascendente gruesa, conducto coleccionista e intersticio. A continuación, el ARN se aísla de los compartimentos obtenidos y se lleva a cabo la secuenciación de ARN para determinar los cambios en la firma transcriptómica dentro de cada subsegmento.

Aplicación de microdisección láser para descubrir transcriptómica regional en tejido renal humano

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

3.8K vistas.  Indiana University School of Medicine. Describimos un protocolo para la microdisección láser de subsegmentos del riñón humano, incluyendo el glomérulo, tubérculo proximal, extremidad ascendente gruesa, conducto coleccionista e intersticio. A continuación, el ARN se aísla de los compartimentos obtenidos y se lleva a cabo la secuenciación de ARN para determinar los cambios en la firma transcriptómica dentro de cada subsegmento.

Video: Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Láser microdisección de captura de tejidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Investigación

Biología

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Microdisección láser aplicada a perfiles de expresión génica de subconjunto de las células de la Drosophila Ala Disco

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Un protocolo de microdisección de captura láser que produce ARN de alta calidad a partir de huesos de ratón congelados

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Secuenciación de ARN-Secuenciación de ARN-Captura láser para Análisis de Expresión Genética Espacial y Temporal Específica de Tejidos en Plantas

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high efficiency. Normal kidney tubuloids recapitulate many aspects of their tissue of origin. They represent distinct nephron segments - most notably of the proximal tubule, loop of Henle, distal tubules, and collecting duct - and can be used to study normal kidney physiology. Furthermore, tubuloid technology facilitates disease modeling, e.g., for infectious diseases as well as for cancer. Obtaining kidney epithelial cells for tubuloid generation is, however, dependent on leftover surgical material (such as partial) nephrectomies) or needle biopsies. The ability to grow tubuloids from urine would provide an alternative, less invasive source of healthy kidney epithelial cells. It has been previously shown that tubuloid cultures can be successfully generated from only a few milliliters of freshly collected urine. This article describes the protocols to generate and propagate ASC-derived human kidney tubuloid cultures from tissue and urine samples.

Human kidney tubuloid cultures represent a valuable in vitro model to study kidney physiology and disease. Tubuloids can be established from kidney tissue (healthy and diseased) as well as urine, the latter representing an easily obtainable and less invasive source of research material.

Generación de tubuloides renales humanos a partir de tejidos y orina

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Microdisección láser para aplicaciones de un solo tejido independientes de la especie

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...