일반: 저자는 신장 정밀 의학 프로젝트 (www.kpmp.org)의 조사자들에게 은혜로운 지원과 조언을 감사드립니다.
자금 조달: 이 작업에 대한 지원은 NIH /NIDDK K08DK107864 (M.T.E.)에 의해 제공되었다; NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). 이 원고에서 보고된 연구는 국립 당뇨병 및 소화 및 신장 질환 연구소(NIDDK) 신장 정밀 의학 프로젝트(KPMP),(www.kpmp.org)에 의해 지원되었으며, 수상 번호 U2CDK114886에 의해 지원되었다.
데이터 및 재료 가용성: 데이터는 유전자 발현 옴니버스에 보관됩니다(GEO # 보류 중)

이 연구는 인디애나 대학의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 사용을 위해 승인되었습니다.
참고: 신장 신장 절제술 조직(X 및 Y 치수 모두에서 최대 2cm)을 사용하여 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물에 보존되어 -80°C에 저장됩니다. RNA 오염을 제한하고 깨끗한 일회용 장갑과 얼굴 마스크를 사용하는 방식으로 모든 작업을 수행하십시오. 모든 표면의 청결을 보장합니다. 이 프로토콜을 최적화한 장비는 펄스 UV 레이저를 특징으로 하는 레이저 마이크로디섹션 시스템입니다.
1. 냉동 절제
<ol><li>1.2 μm LMD PPS-멤브레인(폴리(p-phenylene 황화물)을 자외선(조직 배양 라미나르 플로우 후드)에 30분 간 미끄러져 냉동절부전을 노출한다. 최적의 조직 준수를 위해 실온에서 슬라이드를 저장합니다.</li>
	<li>저온을 -20°C로 식힙니다. 작업 표면을 청소하고 새로운 절단 블레이드를 설치합니다.</li>
	<li>냉동실 내부에 작은 슬라이드 박스(RNase 표면 오염 제거 용액으로 세척)를 배치하여 갓 자른 조직으로 슬라이드를 보관합니다.</li>
	<li>10월에 시편을 조직 홀더에 부착하고 챔버 온도에 도달하고 OCT 블록과 홀더 사이의 접착력을 강화하기 위해 몇 분 동안 평형화할 수 있도록 한다. 열 추출기사용으로 공정을 지원합니다.</li>
	<li>시편을 12 μm 두께로 자르고 슬라이드 어댑터를 사용하여 전문 LMD 슬라이드에 부착합니다. 각 슬라이드는 슬라이드 당 또는 슬라이드 당 최대 2 개의 신장 생검 섹션을 보유합니다. 슬라이드를 -80°C에 건조카트리지와 단단히 닫힌 비닐 봉지 안에 저장하여 과도한 수분이 슬라이드 박스 내부에 축적되는 것을 방지합니다.</li>
	<li>각 슬라이드에 표본 ID, 날짜 및 슬라이드 번호로 레이블을 지정합니다.</li>
	<li>극저온 절제의 초기 날짜로부터 10 일 이내에 표본이있는 슬라이드를 사용합니다.</li>
</ol>2. 레이저 마이크로 디스섹션
<ol><li>염색 직전, FITC-Phalloidin의 4 μL을 추가하여 RNase-free PBS에서 항체 믹스(Ab-Mix)를 10% BSA로 준비합니다. DAPI의 1.5 μL, 탐-호르스폴 단백질(THP)의 2μL, 알렉사 플루어 546, RNase 억제제의 3.3 μL, PBS에서 10% BSA의 89.2 μL(100 μL의 부피에 도달)에 직접 공주된다. 참고: 대체 항체는 THP 항체 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 알렉사 플루어(568)에 직접 컨쥬게이트된 메가린/LRP2 항체의 2μL은 근위 튜블러를 라벨에 부착하는 데 사용될 수 있다. Ab-Mix에는 LRP2 또는 THP 항체가 포함되어 있습니다(근위 튜벌레 또는 두꺼운 오름팔다리를 각각 시각화합니다). 다른 항체는 사용자 요구에 따라 검증될 수 있다.</li>
	<li>차가운 얼음 (-20 °C)에서 슬라이드를 1 분 동안 100 % 아세톤으로 씻고 습도 챔버로 이동합니다.</li>
	<li>30 s. 반복에 대 한 RNase 무료 PBS와 슬라이드의 상단을 세척.</li>
	<li>30 s. 반복에 대 한 RNase 무료 PBS에서 10% BSA와 슬라이드의 상단을 세척.</li>
	<li>Ab-Mix를 5분 간 적용합니다.</li>
	<li>30 s. 반복에 대 한 RNase 무료 PBS에서 10% BSA와 슬라이드의 상단을 세척.</li>
	<li>공기는 5 분 동안 슬라이드를 건조하고 레이저 미세 절삭 플랫폼에로드합니다.</li>
	<li>RNA 격리 키트로부터 추출 버퍼 50μL을 포함하는 PCR 작업에 적합한 수집 튜브(자동 0.5mL 마이크로센심분리기 튜브)를 설치합니다.</li>
	<li>LMD를 진행합니다. 대부분의 2시간 이내에 각 LMD 세션을 완료합니다.<ol>
<li>현미경 카메라를 사용하여 전·후 LMD 면역형광 이미지를 수집하여 작업자 간 가변성뿐만 아니라 수행된 프로토콜의 보관 목적, 교육 및 품질 평가를 검증합니다. RNA의 0.5 - 1 ng를 얻기 위해서는 최소 500,000 μm2 영역이 필요합니다. 이것은 종종 관심의 모든 하위 세그먼트에 대한 재료의 충분한 양을 얻기 위해 최대 8 x12 μm 두께의 섹션의 사용을 필요로한다.</li>
		<li>스테인딩, 형태 및 위치로 관심 영역을 식별하고 40보다 큰 레이저 전력을 사용하여 이를 소비합니다. 참고: 해부 기준은 다음과 같습니다. 근위 관은 FITC-Phalloidin 및 LRP2 라벨링에 의해 정의됩니다. 두꺼운 오름차순 사지는 THP 라벨링에 의해 정의됩니다. 수집 덕트는 핵 형태학(DAPI) 및 기타 염색의 부재에 의해 정의됩니다. 사구체는 FITC-판로이드 및 형태에 의해 정의됩니다. 간질은 스테인드 튜블러 사이의 영역으로 정의됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두 개의 12 μm 단면을 LMD 슬라이드에 부착하고 전체 섹션을 추출 버퍼로 해부하여 벌크 단면 식 서명을 가져옵니다.</li>
	<li>LMD 프로세스가 완료되면 수집 마이크로 센심 분리기 튜브를 닫고 적극적으로 움직여 내용이 캡에서 튜브 바닥으로 이동하도록 합니다.</li>
	<li>30 s에 대 한 3,000 x g에서 튜브원심 분리.</li>
	<li>튜브를 42°C의 수조에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>2 분 동안 3,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.</li>
	<li>새로운 0.5 mL 튜브로 상체를 전송하고 -80 °C에 저장합니다.</li>
</ol>3. RNA 절연
참고 : 이 RNA 격리 프로토콜의 경우 상용 RNA 격리 키트의 프로토콜을 적용했습니다. 제조업체의 프로토콜은 프로젝트에 대해 설정된 품질 관리 요구 사항을 충족하도록 수정되었습니다.
<ol><li>각 RNA 정제 컬럼(PC)에 250 μL의 컨디셔닝 버퍼(CB)를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>원심 분리기 모든 PC는 16,000 x g에서1 분 동안 .</li>
	<li>조직 샘플이 있는 튜브에 70%의 에탄올(키트제공)의 50μL을 추가합니다. 위아래로 파이프를 사용하여 샘플을 잘 섞는다. 소용돌이하지 마십시오. 원심 분리하지 마십시오.</li>
	<li>혼합물을 100 x g에서 2 분 동안 조건부 PC및 원심분리기로 옮기십시오 (RNA를 결합하려면), 신속하게 16,000 x g에서 30 s에 대한 원심 분리 (통해 흐름을 제거하기 위해)에 따라. 조직 샘플이 있는 1개 이상의 튜브가 지정된 하위 세그먼트에 사용할 수 있는 경우 이 단계를 반복하십시오.</li>
	<li>8,000 x g에서 1분 동안 PC와 원심분리기에 100 μL의 워시 버퍼 1(WB1)을 넣습니다.</li>
	<li>각 샘플당 40 μL의 DNase를 준비하십시오(RDD 버퍼의 35 μL에 DNase 5 μL 추가). 그런 다음 PC의 멤브레인에 직접 혼합물의 40 μL을 추가하고 실온에서 15 분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PC의 멤브레인에 WB1의 40 μL을 추가하고 원심분리기를 8,000 x g에서 15s에 추가합니다.</li>
	<li>PC 멤브레인에 워시 버퍼 2(WB2)의 100 μL을 추가하고 원심분리기는 8,000 x g에서 1분 동안 추가합니다.</li>
	<li>PC의 멤브레인에 WB2의 100 μL을 추가, 16,000 x g에서2 분 원심 분리기, 즉시 16,000 x g에서1 분 원심 분리에 의해 다음.</li>
	<li>PC를 새로운 0.5mL 튜브로 전송합니다.</li>
	<li>12 μL의 용출 버퍼(EB)를 멤브레인에 넣고 실온에서 7분 동안 배양합니다. 따라서, 풀로 풀화된 모든 해부된 조직 샘플의 최종 부피는 하위 세그먼트당 12 μL이다.</li>
	<li>원심 분리는 1,000 x g에서 1 분 동안 샘플을 원심분리한 다음 16,000 x g에서2 분 동안.</li>
	<li>2 μL을 생체 분석기 분석을 위한 신선한 튜브로 전송합니다(동결 해동 이벤트를 방지하기 위해).</li>
	<li>추가 처리를 위해 준비될 때까지 모든 튜브를 -80°C에 보관하십시오.</li>
</ol>4. RNA 염기서열 분석
<ol><li>상용 Bioanalyzer및 소량의 RNA를 측정하는 데 전념하는 칩을 사용하여 품질을 위해 시퀀싱을 위한 각 샘플을 평가합니다.</li>
	<li>라이브러리 준비 및 시퀀싱 전에 품질 관리(QC) 매개 변수에 따라 필요한: 대량에 대해 4ng보다 큰 RNA의 수량과 각 하위 세그먼트에 대해 0.5 – 1 ng보다 큰; 200개의 뉴클레오티드(DV200)를 초과하는 녹취록의 퍼센트는 LMD 표본(최적 > 75%)의 경우 25% 이상이어야 합니다.</li>
	<li>소량의 저하된 RNA를 위한 상업용 cDNA 라이브러리 준비 키트로 라이브러리 준비를 수행합니다. 보충교재에 기재된 상용 키트의 경우 옵션 2를 사용하는 것이 좋습니다. 일부 시퀀싱 기술은 30%7과같은 더 높은 최소 DV200 임계값을 요구할 수 있습니다.</li>
	<li>cDNA 어댑터 및 인덱스를 추가합니다.</li>
	<li>마그네틱 비드 기술을 사용하여 RNAseq 라이브러리를 정화합니다.</li>
	<li>RNAeq 라이브러리 증폭 단계 전에 상업용 rRNA 제거 키트를 사용하여 리보소말 cDNA를 고갈시다.</li>
	<li>2 ng/μL cDNA 라이브러리 농도에서 자기 비드 기술을 사용하여 최종 RNAseq 라이브러리를 정화합니다.</li>
	<li>상용 시퀀싱 시스템에서 75bp 의 RNA 시퀀싱을 수행하여 3천만 개의 읽기/샘플을 대량으로, 하위 세그먼트 섹션의 경우 1억 개의 읽기/샘플을 제공합니다.</li>
	<li>모든 시퀀싱 실행과 함께 참조 RNA(25 μg)를 사용하여 배치 효과를 제어할 수 있습니다. 우리의 참조 RNA의 초기 농도는 1 μg/μL이고, 시퀀싱에 활용되는 최종 농도는 25 ng/μL입니다. 라이브러리 준비 중에 별도의 샘플로 참조 RNA를 실행하고 매번 모든 LMD 시편과 함께 실행한다.</li>
	<li>FastQC 응용 프로그램을 활용하여 시퀀싱, 간질 및 미토콘드리아 판독의 품질을 평가하고 유전자에 기인하는 읽기를 결정하는 데이터 분석을 수행합니다.</li>
	<li>통합 유전체학 뷰어(IGV)를 사용하여 정렬 및 edgeR/rbamtools를 사용하여 성적증명서 발현 측정을 제공합니다.</li>
	<li>100,000개 미만의 읽기로 샘플을 제거합니다. 정량적 사용자 정의 임계값에서 낮은 발현 유전자를 필터링 한 후 데이터 세트에서 원시 판독을 정규화합니다.</li>
	<li>다른 모든 하위 세그먼트 및 log2 변환의 평균에 대한 관심 하위 세그먼트의 비율로 식을 정량화합니다. 동일한 유전자의 상대적 발현은 하위 세그먼트 및 샘플에 걸쳐 비교될 수 있습니다. 그러나, 유전자와 RNA 종에 걸친 저하의 잠재적 인 차이로 인해 두 개의 다른 유전자 사이의 상대적 발현을 비교하는 것은 이상적이지 않다.</li>
	<li>참조 RNA 샘플은 배치 전반에 걸쳐 비교되는 동안, 각 nephron 하위 세그먼트에 특정 제조 업체의 집합에 대한 유전자 발현을 비교하는 농축 분석을 수행. R 값 > 0.9를 사용하는 평균 식의 1표준 편차 내에서 일괄 처리 효과가 허용되는 것으로 간주됩니다. 더 높은 배치 효과 점수에는 추가 정규화가 필요합니다. 허용된 일괄 처리 효과에서 벗어난 모든 실행은 플래그를 지정할 수 있습니다. Q30은 각 시퀀싱 실행에 대해 >90%보다 커야 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

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LMD 기반 전사학은 조직 내의 특정 영역에 유전자 발현을 고정시키는 유용한 기술이다. 이 기술의 기초와 신장에 그것의 잠재적인 응용은 이전에 기술되었습니다8. 그러나, 특히 다운스트림 RNA 시퀀싱을 위한 고정밀 해부를 겨냥한 형광 계 해분의 최적화, 현대화 및 합리화는 덜 유비쿼터스이다. 이 방법론은 조직 내 공간적으로 접지되기 때문에 조직 구조에서 새로운 또는 과소 ?...

조직 표본을 연구하는 기술 발전은 다양한 장기에서 건강과 질병의 상태에 대한 이해를 향상했습니다. 그 같은 어드밴스는 병리학이 제한된 지역 또는 특정 세포 모형에서 시작할 수 있다는 것을 강조했습니다, 그러나 전체 기관에 중요한 연루가 있습니다. 따라서, 현재 개인화된 의학의 시대에, 세포와 지역 적 수준 모두에서 생물학을 이해하는 것이 중요하고 전 세계적으로1. 이것은 다양 한 전문된 세포와 병리학적 스트레스에 분화 및/또는 반응 하는 구조로 구성 되는 신장에서 특히 사실이다. 인간 신장 병의 각종 모형의 병신은 아직도 잘 이해되지 않습니다. 특정 관 세그먼트에서 유전자 발현의 변화를 연구하는 방법론을 생성, 구조 또는 인간의 신장에 있는 interstitium의 지역은 질병의 병인에 통보할 수 있는 지역 특정 변경을 밝히는 기능을 향상할 것입니다.
인간의 신장 생검 표본은 제한적이고 귀중한 자원입니다. 따라서 신장 조직에서 전사학을 심문하는 기술은 조직을 경제화하도록 최적화되어야 합니다. 세포 및 지역 수준에서 전사학을 연구하는 이용 가능한 방법은 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNaseq), 단일 핵 RNaseq(snRNaseq), 현장에서 공간 혼성화 및 레이저 미세 절(LMD)을 포함한다. 후자는 다운스트림 RNA 시퀀싱 및분석2,3,4,5에대한 조직 섹션 내의 관심 영역 또는 구조의 정확한 격리에 적합합니다. LMD는 해부 도중 형광 기지를 둔 화상 진찰을 사용하여 검증된 마커를 기반으로 특정 세포 모형 또는 구조물의 식별에 의지하기 위하여 채택될 수 있습니다.
레이저 미세 절 보조 지역 전사학의 독특한 특징은 다음과 같습니다 : 1) 세포와 구조의 공간 컨텍스트의 보존, 이는 세포가 조직학적으로 보다는 발현에 의해 식별되는 단하나 세포 기술을 보완; 2) 항체 마커가 발현 서명을 정의하기 때문에 기술은 다른 이미징 기술에 의해 통보되고 통보된다. 3) 마커가 질병에서 변경되는 경우에도 구조를 식별하는 능력; 4) 대략 20,000의 유전자에 있는 낮은 발현된 전사체의 검출; 그리고 5) 놀라운 조직 경제. 이 기술은 충분한 RNA 획득에 필요한 코어의 100 μm 두께 미만의 신장 생검으로 확장가능하며, 대형 저장소 또는 학술 센터6에서일반적으로 제공되는 보관된 냉동 조직의 사용을 가능하게 한다.
후속 작업에서, 우리는 인간 신장 조직과 함께 사용하기위한 새로운 빠른 형광 염색 프로토콜에 최적화 된 지역 및 대량 전사 기술을 자세히 설명합니다. 이 방법은 고전적인 LMD 탐색을 개선하는데, 이는 골재 튜튜인터테리아식과는 달리 간질 및 신장계 하위 세그먼트에 대한 별도의 식 데이터를 제공하기 때문입니다. 엄격하고 재현성을 보장하기 위해 구현된 품질 보증 및 제어 조치가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 세포와 관심 영역의 시각화를 가능하게 하여 이러한 고립된 영역에서 RNA를 만족스러운 획득하여 다운스트림 RNA 시퀀싱을 허용합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

인간 신장 조직의 유전자 발현 분석은 항상성 및 질병 병리학을 이해하는 중요한 도구입니다. 이 기술의 해상도와 깊이를 증가시키고 조직 내의 세포 수준으로 확장하는 것이 필요합니다. 단일 핵 및 단일 세포 RNA 염기서열 분석의 사용이 널리 퍼져 있지만, 조직 해리로부터 얻은 세포의 발현 서명은 공간 맥락을 유지하지 못한다. 레이저 미세 절제 (LMD)는 특정 형광 마커에 기초하여 알려진 국소화와 관심의 특정 구조 및 세포 그룹의 격리를 허용하여 신장 조직에서 공간적으로 고정 된 전사 적 서명을 획득 할 수 있게합니다. 우리는 빠른 형광 계 얼룩에 의해 유도LMD 방법론을 최적화했습니다, 인간 신장 내의 5개의 별개의 구획을 격리하고 귀중한 인간 신장 조직 견본에서 후속 RNA 순서를 실시하기 위하여. 우리는 또한 수집 된 표본의 적합성 평가를 가능하게하는 품질 관리 매개 변수를 제시합니다. 이 원고에 설명된 워크플로우는 이 접근 방식의 타당성을 보여 주며, 높은 확신을 가지고 하위 세그먼트 전사 서명을 분리합니다. 여기에 제시된 방법론적 접근법은 또한 관련 항체 마커의 대체를 가진 그밖 조직 모형에 적용될 수 있습니다.

샘플
우리는 신장 신장 신장 세그먼트 및 간질 지역을 격리하기 위하여 급속한 형광 염색 프로토콜을 활용하여 9개의 참조 신장 절제술 (인디애나 대학에서 얻은 3개의 견본 및 신장 정밀 의학 프로젝트를 통해 얻은 6개의 견본)에서 데이터를 제시합니다. 이 과정에서 활용된 단면은 죽은 신장 기증자 또는 영향을 받지 않는 종양 신장 절제술에서 얻어졌습니다. 이...

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Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

우리는 사구체, 근위 관, 두꺼운 상승 사지, 수집 덕트 및 간질염을 포함하여 인간 신장의 하위 세그먼트의 레이저 미세 절제에 대한 프로토콜을 설명합니다. RNA는 얻어진 구획및 RNA 시퀀싱으로부터 분리되어 각 하위 세그먼트 내의 전사 서명의 변화를 결정한다.

인간 신장 조직에서 지역 전사학을 밝히기 위해 레이저 미세 절제술의 응용 프로그램

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

application-laser-microdissection-to-uncover-regional-transcriptomics

Research

JoVE Journal

Biology

3.8K 조회수.  Indiana University School of Medicine. 우리는 사구체, 근위 관, 두꺼운 상승 사지, 수집 덕트 및 간질염을 포함하여 인간 신장의 하위 세그먼트의 레이저 미세 절제에 대한 프로토콜을 설명합니다. RNA는 얻어진 구획및 RNA 시퀀싱으로부터 분리되어 각 하위 세그먼트 내의 전사 서명의 변화를 결정한다.

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Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

포유 동물 조직의 레이저 캡처 Microdissection

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

연구

생물학

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

마우스입니다 관류 신장 기법

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

신선 냉동 마우스 뼈에서 고품질 RNA를 생성하는 레이저 캡처 미세 해부 프로토콜

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

레이저 캡처 미세 절 RNA-시퀀싱 용 공간 및 측두 조직 -특정 유전자 발현 분석

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails significantly fewer preparation-induced changes than isolated islets, acini, ducts, or dispersed cells described in typical in vitro studies. By combining the acute pancreatic tissue slice with live-cell calcium imaging in confocal laser scanning microscopy (CLSM), calcium signals can be studied in a large number of endocrine and exocrine cells simultaneously, with a single-cell or even subcellular resolution. The sensitivity permits the detection of changes and enables the study of intercellular waves and functional connectivity as well as the study of the dependence of physiological responses of cells on their localization within the islet and paracrine relationship with other cells. Finally, from the perspective of animal welfare, recording signals from a large number of cells at a time lowers the number of animals required in experiments, contributing to the 3R-replacement, reduction, and refinement-principle.

We present the preparation of acute pancreatic tissue slices and their use in confocal laser scanning microscopy to study calcium dynamics simultaneously in a large number of live cells, over long time periods, and with high spatiotemporal resolution.

급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high efficiency. Normal kidney tubuloids recapitulate many aspects of their tissue of origin. They represent distinct nephron segments - most notably of the proximal tubule, loop of Henle, distal tubules, and collecting duct - and can be used to study normal kidney physiology. Furthermore, tubuloid technology facilitates disease modeling, e.g., for infectious diseases as well as for cancer. Obtaining kidney epithelial cells for tubuloid generation is, however, dependent on leftover surgical material (such as partial) nephrectomies) or needle biopsies. The ability to grow tubuloids from urine would provide an alternative, less invasive source of healthy kidney epithelial cells. It has been previously shown that tubuloid cultures can be successfully generated from only a few milliliters of freshly collected urine. This article describes the protocols to generate and propagate ASC-derived human kidney tubuloid cultures from tissue and urine samples.

Human kidney tubuloid cultures represent a valuable in vitro model to study kidney physiology and disease. Tubuloids can be established from kidney tissue (healthy and diseased) as well as urine, the latter representing an easily obtainable and less invasive source of research material.

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...