Genel: Yazarlar, Böbrek Hassas Tıp Projesi (www.kpmp.org) araştırmacılarına nazik destekleri ve tavsiyeleri için teşekkür eder.
Finansman: Bu çalışma için destek NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Bu yazıda bildirilen araştırmalar, U2CDK114886 ödül numarası altında Ulusal Diyabet ve Sindirim Enstitüsü (NIDDK) Böbrek Hassas Tıp Projesi (KPMP), (www.kpmp.org) tarafından desteklenmiştir.
Veri ve malzeme kullanılabilirliği: Veriler Omnibus Gen İfadesi'nde arşivlenmiştir (GEO # beklemede)

Çalışma Indiana Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından kullanılmak üzere onaylandı.
NOT: Bu protokolü, Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiminde korunmuş ve -80 °C'de depolanan böbrek nefrektomi dokusuyla (hem X hem de Y boyutlarında 2 cm'ye kadar) kullanın. Tüm çalışmaları RNA kontaminasyonini sınırlayan bir şekilde gerçekleştirin, temiz tek kullanımlık eldivenler ve yüz maskesi kullanın. Tüm yüzeylerin temizliğini sağlayın. Bu protokolün optimize edildiği ekipman, darbeli UV lazer içeren bir lazer mikrodiseksiyon sistemidir.
1. Kriyoseksiyon
<ol><li>Kriyoseksiyondan hemen önce 30 dakika boyunca 1,2 μm LMD PPS-membran (poli (p-fenilen sülfit) slaytlarını UV ışığına (doku kültürü laminer akış davlumbazında) maruz bırakın. Optimum doku yapışağı için slaytları oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Kriyostatı -20 °C'ye soğutun. Çalışma yüzeylerini temizleyin ve yeni bir kesme bıçağı takın.</li>
	<li>Slaytları taze kesilmiş dokuyla saklamak için kriyostat odasının içine küçük bir slayt kutusu (RNase yüzey dekontaminasyon çözeltisi ile temizlenir) yerleştirin.</li>
	<li>OCT'deki numuneyi bir doku tutucuya yapıştırın ve oda sıcaklığına ulaşmak ve OCT bloğu ile tutucu arasındaki yapışma kuvvetini güçlendirmek için birkaç dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Bir ısı çıkarıcı kullanarak işleme yardımcı olmak.</li>
	<li>Numuneyi 12 μm kalınlıkta kesin ve slayt adaptörünü kullanarak özel LMD slaydına yapıştırın. Her slaytta slayt başına bir nefrektomi bölümü veya slayt başına en fazla iki böbrek biyopsisi bölümü vardır. Slayt kutusunun içinde fazla nemin birikmesini önlemek için slaytları -80 °C'de kurutucu bir kartuşla ve sıkıca kapalı bir plastik torbanın içinde saklayın.</li>
	<li>Her slaydı örnek kimliği, tarih ve slayt numarasıyla etiketleyin.</li>
	<li>İlk kriyoseksiyon tarihinden itibaren 10 gün içinde örnekleri içeren slaytları kullanın.</li>
</ol>2. Lazer mikro disseksiyon
<ol><li>Boyamadan hemen önce, antikor karışımını (Ab-Mix) RNase içermeyen PBS'de% 10 BSA'da aşağıdakileri ekleyerek hazırlayın: 4 μL FITC-Phalloidin, 1,5 μL DAPI, 2 μL Tamm-Horsfall Protein (THP) antikor doğrudan Alexa Fluor 546, 3,3 μL RNase Inhibitörü ve PBS'de % 10 BSA'nın 89,2 μL'si (100 μL hacme ulaşmak için). NOT: THP antikorunun yerine alternatif antikorlar kullanılabilir. Örneğin, doğrudan Alexa Fluor 568'e konjuge edilen 2 μL megalin/LRP2 antikoru proksimal tübül etiketlemek için kullanılabilir. Ab-Mix LRP2 veya THP antikoru içerir (sırasıyla proksimal tübülleri veya kalın yükselen uzuvları görselleştirmek için). Diğer antikorlar kullanıcı ihtiyaçlarına göre doğrulanabilir.</li>
	<li>Kaydırağı buz gibi (-20 °C) %100 asetonda 1 dakika yıkayın ve nem odasına taşıyın.</li>
	<li>Slastanın üst kısmını RNase içermeyen PBS ile 30 sn boyunca yıkayın.</li>
	<li>Slaydın üst kısmını RNase içermeyen PBS'de %10 BSA ile 30 sn boyunca yıkayın.</li>
	<li>Ab-Mix'i 5 dakika uygulayın.</li>
	<li>Slaydın üst kısmını RNase içermeyen PBS'de %10 BSA ile 30 sn boyunca yıkayın.</li>
	<li>Kaydırağı 5 dakika boyunca havayla kurulayın ve lazer mikroseksiyon kesme platformuna yükleyin.</li>
	<li>RNA izolasyon kitinden 50 μL Ekstraksiyon Tamponu içeren PCR çalışması için uygun toplama tüplerini (otomatik olarak kapatılmış 0,5 mL mikrosantrifüj tüpler) takın.</li>
	<li>LMD ile devam edin. Her LMD oturumunu en fazla 2 saat içinde tamamlayın.<ol>
<li>Operatörler arası değişkenliğin yanı sıra arşivleme amaçları, gerçekleştirilen protokolün eğitimi ve kalite değerlendirmesi için diseksiyonu doğrulamak için mikroskop kamerayı kullanarak LMD öncesi ve sonrası immünofluoresans görüntülerini toplayın. 0,5 – 1 ng RNA elde etmek için en az 500.000 μm2 alan gereklidir. Bu genellikle tüm alt ilgi segmentleri için yeterli miktarda malzeme elde etmek için 8 x12 μm kalınlıkta bölümlerin kullanılmasını gerektirir.</li>
		<li>Boyama, morfoloji ve konum olarak ilgi çekici bölgeleri belirleyin ve 40'tan büyük lazer gücü kullanarak bunları çıkarın. NOT: İşte diseksiyon kriterleri. Proksimal tübül FITC-Phalloidin ve LRP2 etiketlemesi ile tanımlanır. Kalın yükselen uzuv THP etiketleme ile tanımlanır. Toplama kanalı nükleer morfoloji (DAPI) ve diğer lekelerin olmaması ile tanımlanır. Glomerulus FITC-Phalloidin ve morfoloji ile tanımlanır. Intersitium lekeli tübüller arasındaki alan olarak tanımlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LMD slaydına iki adet 12 μm bölüm yapıştırarak ve tüm bölümleri ayıklama arabelleğine keserek toplu kesitsel ifade imzası elde edin.</li>
	<li>LMD işlemi tamamlandıktan sonra, toplama mikrosantrifüj tüplerini kapatın ve içeriğin kapaktan tüpün altına taşındığından emin olmak için kuvvetlice kaydırın</li>
	<li>Tüpleri 30 s için 3.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Tüpleri 42 °C su banyosunda 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüpleri 2 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatant'ı yeni bir 0,5 mL tüpe aktarın ve -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>3. RNA izolasyonu
NOT: Bu RNA yalıtım protokolü için, ticari bir RNA yalıtım kitinden bir protokol uyarladık. Üreticinin protokolü, proje için belirlenen kalite kontrol gereksinimlerini karşılayacak şekilde değiştirilmiştir.
<ol><li>Her RNA arıtma sütununa (PC) 250 μL Şartlandırılmış Tampon (CB) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüm bilgisayarları 16.000 x g'da 1 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Doku örnekleri ile tüplere %70 etanol (Kit'te bulunur) 50 μL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak numuneleri iyice karıştırın. Girdap yapmayın. Santrifüj yapmayın.</li>
	<li>Karışımı 100 x g'da 2 dakika boyunca şartlandırılmış pc'lere ve santrifüje aktarın (RNA'yı bağlamak için), 16.000 x g'da 30 s santrifüjleme ile hızla takip edin (akışı kaldırmak için). Herhangi bir alt segment için doku örnekleri içeren 1'den fazla tüp varsa bu adımı tekrarlayın.</li>
	<li>Pc'lere 100 μL Yıkama Tamponu 1 (WB1) ekleyin ve 8.000 x g'da1 dakika santrifüj ekleyin.</li>
	<li>Her numune başına 40 μL DNase hazırlayın (35 μL RDD arabelleğe 5 μL DNase ekleyin). Daha sonra doğrudan PC'nin zarı üzerine 40 μL karışım ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PC'nin zarına 40 μL WB1 ekleyin ve 8.000 x g'da15 s için santrifüj ekleyin.</li>
	<li>PC'nin zarına 100 μL Yıkama Tamponu 2 (WB2) ekleyin ve 8.000 x g'da1 dakika santrifüj ekleyin.</li>
	<li>PC'nin zarına 100 μL WB2 ekleyin, 16.000 x g'da2 dakika santrifüj , hemen ardından 16.000 x g'da1 dakika santrifüjleme.</li>
	<li>Bilgisayarı yeni bir 0,5 mL tüpe aktarın.</li>
	<li>Membrana 12 μL Elution Buffer (EB) ekleyin ve oda sıcaklığında 7 dakika kuluçkaya yatırın. Böylece, havuza alınan tüm diseksiyonlu doku örneklerinin son hacmi alt segment başına 12 μL'dir.</li>
	<li>Numuneleri 1.000 x g'da 1 dakika ve ardından 16.000 x g'da 2 dakika santrifüj. </li>
	<li>Biyoanalyzer analizi için 2 μL'yi taze bir tüpe aktarın (donma-çözülme olaylarını önlemek için).</li>
	<li>Tüm tüpleri daha fazla işleme hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>4. RNA dizilimi
<ol><li>Ticari bir Biyoanalyzer ve küçük miktarlarda RNA ölçmeye adanmış bir çip kullanarak kalite için sıralamaya yönelik her numuneyi değerlendirin.</li>
	<li>Kütüphane hazırlığı ve dizilemesi öncesinde aşağıdaki kalite kontrol (QC) parametreleri gereklidir: Toplu olarak 4 ng'den ve her alt segment için 0,5 – 1 ng'den büyük RNA miktarı; 200 nükleotitten (DV200) uzun transkriptlerin yüzdesinin LMD örnekleri için %25'ten büyük olması gerekir (optimal > %75).</li>
	<li>Küçük miktarlarda bozulmuş RNA için tasarlanmış ticari bir cDNA kütüphane hazırlama kiti ile kütüphane hazırlığı gerçekleştirin. Ekte listelenen ticari kit için, minimum DV200% 25 ve parçalanma gerektirmeyen Seçenek 2'yi kullanmanızı öneririz. Bazı sıralama teknolojileri% 307gibi daha yüksek minimum DV200 eşikleri gerektirebilir.</li>
	<li>cDNA bağdaştırıcıları ve dizinleri ekleyin.</li>
	<li>Manyetik boncuk teknolojisini kullanarak RNAseq kitaplıklarını arındırın.</li>
	<li>RNAseq kitaplık amplifikasyon adımından önce ticari bir rRNA kaldırma kiti kullanarak ribozomal cDNA'yı tükenmesi.</li>
	<li>2 ng/μL cDNA kütüphane konsantrasyonundaki manyetik boncuk teknolojisini kullanarak son RNAseq kütüphanesini arındırın.</li>
	<li>Toplu olarak 30 milyon okuma/örnek ve alt segmental bölümler için 100 milyon okuma/örnek ile ticari bir sıralama sisteminde 75 bp eşleştirilmiş uç RNA dizilimini gerçekleştirin.</li>
	<li>Toplu iş efektinin kontrolüne izin vermek için her sıralama çalıştırmasıyla bir Referans RNA (25 μg) kullanın. Referans RNA'mızın ilk konsantrasyonu 1 μg/μL iken, sıralamada kullanılan son konsantrasyon 25 ng/μL'dir.</li>
	<li>Sıralama, interjenik ve mitokondriyal okumaların kalitesini değerlendirmek ve bir gene atfedilen okumaları belirlemek için FastQC uygulamasını kullanarak veri analizi yapın.</li>
	<li>Hizalama için Bütünleştirici Genomik Görüntüleyici (IGV) ve transkript ifade ölçümleri için edgeR/rbamtools kullanın.</li>
	<li>100.000'den az okuma ile örnekleri kaldırın. Quantile, kullanıcı tanımlı bir eşikte düşük ifade edilen genleri filtreledikten sonra veri kümesindeki ham okumaları normalleştirir.</li>
	<li>İfadeyi, ilgili alt segmentin diğer tüm alt segmentlerin ortalamasına bir oranı olarak ölçün ve log2 dönüşümü yapın. Aynı genin bağıl ekspresy edilmesi alt segmentler ve örnekler arasında karşılaştırılabilir; bununla birlikte, genler ve RNA türleri arasındaki potansiyel bozulma farklılıkları nedeniyle iki farklı gen arasındaki bağıl ifadeyi karşılaştırmak ideal değildir.</li>
	<li>Referans RNA örnekleri partiler arasında karşılaştırılırken, her nefron alt segmentine özgü bir dizi üretici için gen ekspresyonını karşılaştırmak için bir zenginleştirme analizi gerçekleştirin. R değeri > 0.9 olan ortalama ifadenin 1 standart sapması içindeki bir toplu iş efekti kabul edilebilir olarak kabul edilir. Daha yüksek bir toplu iş efekti puanı için ek normalleştirme gereklidir. Kabul edilen toplu iş efektinden sapan herhangi bir çalıştırma işaretlenebilir. Q30, her sıralama çalıştırması için >%90'dan büyük olmalıdır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

LMD tabanlı transkriptomik, gen ekspresyonını doku içindeki belirli alanlara tutturan yararlı bir teknolojidir. Bu teknolojinin temeli ve böbrekteki potansiyel uygulaması daha önce tanımlanmıştır8. Bununla birlikte, özellikle aşağı akış RNA dizilimi için yüksek doğruluk diseksiyonunu amaçlayan floresan bazlı diseksiyonun optimizasyonu, modernizasyonu ve düzene sokulması daha az yaygındır. Bu metodoloji doku içinde mekansal olarak topraklandığı için, doku yapıların...

Doku örneklerinin incelenmesindeki teknolojik gelişmeler, çeşitli organlardaki sağlık ve hastalık durumunun anlaşılmasını geliştirlemiştir. Bu tür gelişmeler, patolojinin sınırlı bölgelerde veya belirli hücre tiplerinde başlayabileceğinin altını çizmiştir, ancak tüm organ üzerinde önemli etkileri vardır. Bu nedenle, kişiselleştirilmiş tıbbın mevcut çağında, biyolojiyi sadece küresel olarak değil, hem hücre hem de bölgesel düzeyde anlamak önemlidir1. Bu, özellikle patolojik stresi farklı olarak başlatan ve / veya yanıt veren çeşitli özel hücre ve yapılardan oluşan böbrekte geçerlidir. Çeşitli insan böbrek hastalığı türlerinin patogenezi hala iyi anlaşılamamıştır. İnsan böbreğindeki interstiyumun belirli tübüler segmentlerinde, yapılarında veya alanlarında gen ifadesindeki değişiklikleri incelemek için bir metodoloji oluşturmak, hastalığın patogenezini bilgilendirebilecek bölgeye özgü değişiklikleri ortaya çıkarma yeteneğini artıracaktır.
İnsan böbrek biyopsisi örnekleri sınırlı ve değerli bir kaynaktır. Bu nedenle, böbrek dokusundaki transkriptomiyi sorgulayan teknolojiler dokuyu ekononize etmek için optimize edilmelidir. Hücre ve bölgesel düzeyde transkriptomikleri incelemek için mevcut yöntemler arasında tek hücreli RNA dizilimi (scRNaseq), tek nükleer RNaseq (snRNaseq), in situ mekansal hibridizasyon ve lazer mikrodiseksiyon (LMD) sayilebilir. İkincisi, aşağı akış RNA dizilimi ve analizi 2 ,3,4,5için doku bölümlerindeki bölgelerin veya ilgi çekici yapıların hassas izolasyonu için çok uygundur. LMD, diseksiyon sırasında floresan bazlı görüntüleme kullanılarak doğrulanmış belirteçlere dayalı belirli hücre tiplerinin veya yapılarının tanımlanmasına dayanarak benimsenebilir.
Lazer mikroseksiyon destekli bölgesel transkriptominin benzersiz özellikleri şunlardır: 1) hücrelerin histolojik olarak değil ifade ile tanımlandığı tek hücre teknolojilerini tamamlayan hücre ve yapıların mekansal bağlamının korunması; 2) bir antikor işaretçisi ifade imzalarını tanımladığı için teknoloji diğer görüntüleme teknolojilerini bilgilendirir ve bilgilendirir; 3) hastalıkta belirteçler değiştiğinde bile yapıları tanımlama yeteneği; 4) yaklaşık 20.000 gende düşük eksprese transkriptlerin tespiti; ve 5) olağanüstü doku ekonomisi. Teknoloji, yeterli RNA alımı için gerekli olan bir çekirdeğin 100 μm kalınlığından daha az olan bir böbrek biyopsisi için ölçeklenebilir ve büyük depolarda veya akademik merkezlerde yaygın olarak bulunan arşivlenmiş donmuş dokunun kullanılmasını sağlar6.
Devam eden çalışmada, insan böbrek dokusu ile kullanılmak üzere yeni bir hızlı floresan boyama protokolü ile optimize edilmiş bölgesel ve toplu transkriptomik teknolojiyi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu yaklaşım klasik LMD keşifleri üzerinde geliştirir, çünkü toplama tubulointerstitial ifadenin aksine interstiyum ve nefron alt segmentleri için ayrı ifade verileri sağlar. Titizlik ve tekrarlanabilirlik sağlamak için uygulanan kalite güvence ve kontrol önlemleri dahildir. Protokol, hücrelerin ve ilgi alanlarının görselleştirilmesini sağlar ve bu da aşağı akış RNA dizilimine izin vermek için bu yalıtılmış alanlardan RNA'nın tatmin edici bir şekilde alınmasına neden olur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

İnsan böbrek dokusunun gen ekspresyon analizi homeostaz ve hastalık patofizyolojisini anlamak için önemli bir araçtır. Bu teknolojinin çözünürlüğünün ve derinliğinin arttırılması ve doku içindeki hücre seviyesine kadar genişletilmesi gerekir. Tek nükleer ve tek hücreli RNA diziliminin kullanımı yaygınlaşmış olsa da doku ayrışmasından elde edilen hücrelerin ifade imzaları mekansal bağlamı korumamaktadır. Belirli floresan belirteçlere dayanan lazer mikrodiseksiyon (LMD), bilinen lokalizasyon ile belirli yapıların ve hücre gruplarının izolasyonuna izin verecek ve böylece böbrek dokusunda mekansal bağlantılı transkriptomik imzaların elde edilmesini sağlayacaktır. hızlı floresan bazlı bir leke tarafından yönlendirilen bir LMD metodolojisini, insan böbreği içindeki beş ayrı bölmeyi izole etmek ve değerli insan böbrek dokusu örneklerinden sonraki RNA dizilimini yapmak için optimize ettik. Ayrıca, toplanan numunelerin yeterliliğinin değerlendirilmesini sağlamak için kalite kontrol parametreleri sunuyoruz. Bu yazıda özetlenen iş akışı, alt segmental transkriptomik imzaları yüksek güvenle izole etmek için bu yaklaşımın fizibilitesini göstermektedir. Burada sunulan metodolojik yaklaşım, ilgili antikor belirteçlerinin ikame edilmesi ile diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Örnekleri
Böbrek nefron segmentlerini ve interstisyel alanları izole etmek için hızlı floresan boyama protokolünü kullanarak dokuz referans nefrektomiden (Indiana Üniversitesi'nde elde edilen 3 örnek ve Böbrek Hassas Tıp Projesi ile elde edilen 6 örnek) verileri sunuyoruz. Bu süreçte kullanılan bölümler vefat eden böbrek donörlerinden veya etkilenmemiş tümör neforektomilerinden elde edildi. Bu örneklerde bitişik bölümlerden alınan H&E lekesinde gör...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.

İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

application-laser-microdissection-to-uncover-regional-transcriptomics

Research

JoVE Journal

Biology

3.8K Görüntüleme.  Indiana University School of Medicine. Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.

Video: Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Biyoloji

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Bitkilerde Mekansal ve Zamansal Dokuya Özgü Gen Ekspresyonu Analizi için Lazer Yakalama Mikrodiszesi RNA-Dizileme

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high efficiency. Normal kidney tubuloids recapitulate many aspects of their tissue of origin. They represent distinct nephron segments - most notably of the proximal tubule, loop of Henle, distal tubules, and collecting duct - and can be used to study normal kidney physiology. Furthermore, tubuloid technology facilitates disease modeling, e.g., for infectious diseases as well as for cancer. Obtaining kidney epithelial cells for tubuloid generation is, however, dependent on leftover surgical material (such as partial) nephrectomies) or needle biopsies. The ability to grow tubuloids from urine would provide an alternative, less invasive source of healthy kidney epithelial cells. It has been previously shown that tubuloid cultures can be successfully generated from only a few milliliters of freshly collected urine. This article describes the protocols to generate and propagate ASC-derived human kidney tubuloid cultures from tissue and urine samples.

Human kidney tubuloid cultures represent a valuable in vitro model to study kidney physiology and disease. Tubuloids can be established from kidney tissue (healthy and diseased) as well as urine, the latter representing an easily obtainable and less invasive source of research material.

Doku ve İdrardan İnsan Böbrek Tubuloidlerinin Üretimi

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Türlerden Agnostik Tek Doku Uygulamaları için Lazer Mikrodiseksiyonu

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...