Allgemeines: Die Autoren danken den Forschern des Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) für ihre gnädige Unterstützung und Beratung.
Finanzierung: Unterstützung für diese Arbeit wurde vom NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.) bereitgestellt; NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Die in diesem Manuskript berichtete Forschung wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), unter der Auszeichnungsnummer U2CDK114886 unterstützt.
Daten- und Materialverfügbarkeit: Die Daten werden im Gene Expression Omnibus (GEO - ausstehend) archiviert.

Die Studie wurde vom Institutional Review Board (IRB) der Indiana University genehmigt.
HINWEIS: Verwenden Sie dieses Protokoll mit Nierennephrektomiegewebe (bis zu 2 cm in der X- und Y-Dimension), das in der Verbindung optimale Schnitttemperatur (OCT) konserviert und bei -80 °C gelagert wird. Führen Sie alle Arbeiten in einer Weise durch, die die RNA-Kontamination begrenzt, verwenden Sie saubere Einweghandschuhe und eine Gesichtsmaske. Sorgen Sie für die Sauberkeit aller Oberflächen. Die Ausrüstung, für die dieses Protokoll optimiert wurde, ist ein Laser-Mikrodissektionssystem mit gepulsten UV-Laser.
1. Kryosektion
<ol><li>1,2 m LMD-PPS-Membran (Poly(p-Phenylensulfid) diaglyzieren, um 30 Minuten lang, unmittelbar vor dem Kryosektions-, UV-Licht (in einer laminaren Strömungshaube) der Gewebekultur aussetzen. Bewahren Sie die Dias bei Raumtemperatur auf, um eine optimale Gewebehaftung zu gewährleisten.</li>
	<li>Kühlen Sie den Kryostat auf -20 °C. Reinigen Sie die Arbeitsflächen und installieren Sie eine neue Schneidklinge.</li>
	<li>Legen Sie eine kleine Schiebebox (mit RNase Oberflächendekontaminationslösung gereinigt) in die Kryostatkammer, um Dias mit frisch geschnittenem Gewebe zu lagern.</li>
	<li>Die Probe in OCT an einem Gewebehalter kleben und einige Minuten ausgrenzen lassen, um die Kammertemperatur zu erreichen und die Haftung zwischen dem OCT-Block und dem Halter zu stärken. Helfen Sie den Prozess mit einem Wärmeabscheider.</li>
	<li>Schneiden Sie die Probe auf eine Dicke von 12 m und befestigen Sie sie mit dem Schiebeadapter auf dem speziellen LMD-Schlitten. Jede Folie enthält einen Nephrektomieabschnitt pro Folie oder bis zu zwei Nierenbiopsieabschnitte pro Folie. Bewahren Sie die Dias bei -80 °C mit einer Entweichpatrone und in einer dicht verschlossenen Plastiktüte auf, um zu verhindern, dass sich überschüssige Feuchtigkeit in der Schiebebox ansammelt.</li>
	<li>Beschriften Sie jede Folie mit einer Muster-ID, einem Datum und einer Foliennummer.</li>
	<li>Verwenden Sie die Dias mit Proben innerhalb von 10 Tagen ab dem ursprünglichen Datum der Kryosektion.</li>
</ol>2. Laser-Mikrodissektion
<ol><li>Bereiten Sie unmittelbar vor der Färbung den Antikörpermix (Ab-Mix) in 10% BSA in RNase-freier PBS vor, indem Sie folgendes hinzufügen: 4 l FITC-Phalloidin, 1,5 l DAPI, 2 L Tamm-Horsfall Protein (THP) Antikörper, die direkt mit Alexa Fluor 546 konjugiert werden, 3,3 l RNase-Inhibitor und 89,2 l von 10 % BSA in PBS (um ein Volumen von 100 l zu erreichen). HINWEIS: Anstelle des THP-Antikörpers können alternative Antikörper verwendet werden. Zum Beispiel können 2 l megalin/LRP2-Antikörper, direkt konjugiert mit Alexa Fluor 568, verwendet werden, um den proximalen Tubuli zu kennzeichnen. Der Ab-Mix enthält entweder LRP2- oder THP-Antikörper (zur Visualisierung von proximalen Tubuli bzw. dicken aufsteigenden Gliedmaßen). Andere Antikörper können je nach Benutzerwunsch validiert werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Rutsche in eiskalt (-20 °C) 100% Aceton für 1 min und bewegen Sie es in die Feuchtigkeitskammer.</li>
	<li>Waschen Sie die Oberseite des Schlittens mit RNase-freien PBS für 30 s. Wiederholen.</li>
	<li>Waschen Sie die Oberseite der Folie mit 10% BSA in RNase-freier PBS für 30 s. Wiederholen.</li>
	<li>Tragen Sie den Ab-Mix für 5 min auf.</li>
	<li>Waschen Sie die Oberseite der Folie mit 10% BSA in RNase-freier PBS für 30 s. Wiederholen.</li>
	<li>Trocknen Sie den Schlitten 5 min lang an der Luft und laden Sie ihn auf die Laser-Mikrodissektionsschneideplattform.</li>
	<li>Installieren Sie die für pcR-Arbeiten geeigneten Sammelrohre (autoklavierte 0,5 ml Mikrozentrifugenrohre), die 50 l Extraktionspuffer aus dem RNA-Isolationskit enthalten.</li>
	<li>Fahren Sie mit LMD fort. Schließen Sie jede LMD-Sitzung innerhalb von höchstens 2 Stunden ab.<ol>
<li>Sammeln Sie Immunfluoreszenzbilder vor und nach der LMD, indem Sie die Mikroskopkamera verwenden, um die Sezierung für die Variabilität zwischen den Bedienern sowie für Archivierungszwecke, Schulungen und Qualitätsbewertungen des durchgeführten Protokolls zu validieren. Um 0,5 – 1 ng RNA zu erhalten, ist ein Minimum von 500.000m2 Fläche erforderlich. Dies erfordert oft die Verwendung von bis zu 8 x 12 m dicken Abschnitten, um eine ausreichende Materialmenge für alle Teilsegmente von Interesse zu erhalten.</li>
		<li>Identifizieren Sie Regionen von Interesse durch Färbung, Morphologie und Lage und verbrauchen Sie sie mit Laserleistung größer als 40. HINWEIS: Hier sind die Sezierkriterien. Die proximale Tubuli wird durch FITC-Phalloidin und LRP2-Etikettierung definiert. Die dicke aufsteigende Extremität wird durch THP-Beschriftung definiert. Der Sammelkanal wird durch kerntechnische Morphologie (DAPI) und das Fehlen anderer Färbungen definiert. Der Glomerulus wird durch FITC-Phalloidin und Morphologie definiert. Das Interstitium ist definiert als der Bereich zwischen gefärbten Tubuli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erhalten Sie eine Massenquerschnittsausdruckssignatur, indem Sie zwei 12-m-Abschnitte an einer LMD-Folie anbringen und die gesamten Abschnitte in den Extraktionspuffer sezieren.</li>
	<li>Schließen Sie nach Abschluss des LMD-Prozesses die sammelnden Mikrozentrifugenrohre und flicken Sie sie kräftig, um sicherzustellen, dass der Inhalt von der Kappe nach unten bewegt wird.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.000 x g für 30 s.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Rohre in 42 °C Wasserbad für 30 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.000 x g für 2 min.</li>
	<li>Den Überstand auf ein neues 0,5 ml-Rohr übertragen und in -80 °C lagern.</li>
</ol>3. RNA-Isolation
HINWEIS: Für dieses RNA-Isolationsprotokoll haben wir ein Protokoll aus einem kommerziellen RNA-Isolationskit angepasst. Das Protokoll des Herstellers wurde geändert, um die für das Projekt festgelegten Anforderungen an die Qualitätskontrolle zu erfüllen.
<ol><li>Fügen Sie jeder RNA-Reinigungssäule (PC) 250 l Bedingten Puffer (CB) hinzu und inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie alle PCs für 1 min bei 16.000 x g.</li>
	<li>Fügen Sie 50 l 70 % Ethanol (im Kit enthalten) in die Röhrchen mit Gewebeproben. Mischen Sie die Proben gut, indem Sie nach oben und unten. Wirbel nicht. Zentrifugieren Sie nicht.</li>
	<li>Das Gemisch in konditionierte PCs und Zentrifuge für 2 min bei 100 x g (zur Bindung der RNA) übertragen, schnell mit Zentrifugation für 30 s bei 16.000 x g folgen (um durchfließen). Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn mehr als 1 Röhrchen mit Gewebeproben für ein bestimmtes Untersegment verfügbar sind.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l Waschpuffer 1 (WB1) in die PCs und Zentrifuge für 1 Minute bei 8.000 x g.</li>
	<li>Bereiten Sie 40 l DNase pro Probe vor (Hinzufügen von 5 l DNase zu 35 L RDD-Puffer). Dann 40 l des Gemischs direkt auf die Membran des PCs geben und 15 min bei Raumtemperatur brüten.</li>
	<li>Fügen Sie 40 l WB1 auf die Membran des PCs und Zentrifuge für 15 s bei 8.000 x g.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l Waschpuffer 2 (WB2) auf die Membran des PCs und Zentrifuge für 1 min bei 8.000 x g.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l WB2 auf die Membran des PCs, Zentrifuge für 2 min bei 16.000 x g, sofort folgen durch Zentrifugation für 1 min bei 16.000 x g.</li>
	<li>Übertragen Sie den PC in ein neues 0,5 ml Rohr.</li>
	<li>Fügen Sie 12 L Elution Buffer (EB) auf die Membran und inkubieren für 7 min bei Raumtemperatur. Somit beträgt das Endvolumen aller gepoolten sezierten Gewebeproben 12 L pro Teilsegment.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben für 1 min bei 1.000 x g und dann für 2 min bei 16.000 x g.</li>
	<li>Übertragen Sie 2 l in ein frisches Rohr für die Bioanalyzer-Analyse (um Frost-Tau-Ereignisse zu verhindern).</li>
	<li>Alle Rohre in -80 °C lagern, bis sie zur Weiterverarbeitung bereit sind.</li>
</ol>4. RNA-Sequenzierung
<ol><li>Bewerten Sie jede Probe, die für die Sequenzierung bestimmt ist, auf Qualität mit einem kommerziellen Bioanalyzer und einem Chip, der der Messung kleiner RNA-Mengen gewidmet ist.</li>
	<li>Folgende Qualitätskontrolle (QC) Parameter vor der Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung sind erforderlich: RNA-Menge größer als 4 ng für Bulk und größer als 0,5 – 1 ng für jedes Teilsegment; Der Prozentsatz der Transkripte, die länger als 200 Nukleotide (DV200) sind, muss für LMD-Proben mehr als 25 % betragen (optimal > 75%).</li>
	<li>Durchführung der Bibliotheksvorbereitung mit einem kommerziellen cDNA-Bibliotheksvorbereitungskit, das für kleine Mengen degradierter RNA bestimmt ist. Für das kommerzielle Kit in der Ergänzung aufgeführt, Wir empfehlen, Option 2, die eine minimale DV200 von 25% und keine Fragmentierung erfordert. Einige Sequenzierungstechnologien erfordern möglicherweise höhere MINDEST-DV200-Schwellenwerte, z. B. 30 %7.</li>
	<li>Fügen Sie cDNA-Adapter und Indizes hinzu.</li>
	<li>Reinigen Sie die RNAseq-Bibliotheken mit magnetisch-perlen-Technologie.</li>
	<li>Erpleft die ribosomale cDNA mit einem kommerziellen rRNA-Entfernungskit vor dem RnAseq-Bibliotheksamplifikationsschritt.</li>
	<li>Reinigen Sie die endgültige RNAseq-Bibliothek mit magnetischer Perlentechnologie bei einer CDNA-Bibliothekskonzentration von 2 ng/L.</li>
	<li>Führen Sie die RNA-Sequenzierung von 75 bp gepaartem Ende auf einem kommerziellen Sequenzierungssystem mit 30 Millionen Lese-/Proben für Bulk und 100 Millionen Lese-/Proben für teilsegmentale Abschnitte durch.</li>
	<li>Verwenden Sie bei jedem Sequenzierungslauf eine Referenz-RNA (25 g), um die Steuerung des Batch-Effekts zu ermöglichen. Die Anfangskonzentration unserer Referenz-RNA beträgt 1 g/l, während die bei der Sequenzierung verwendete Endkonzentration 25 ng/l beträgt. Führen Sie die Referenz-RNA während der Bibliotheksvorbereitung als separate Probe aus und laufen Sie jeweils mit allen LMD-Proben.</li>
	<li>Führen Sie datenanalysen unter Verwendung der FastQC-Anwendung durch, um die Qualität der Sequenzierung, intergene und mitochondriale Lesevorgänge zu bewerten und Lesevorgänge zu bestimmen, die einem Gen zugeschrieben werden.</li>
	<li>Verwenden Sie Integrative Genomics Viewer (IGV) für Ausrichtung und edgeR/rbamtools für Transkriptexpressionsmessungen.</li>
	<li>Entfernen Sie Proben mit weniger als 100.000 Lesevorgängen. Quantile normalisieren die Rohlesevorgänge im Datensatz, nachdem niedrig ausgedrückte Gene an einem benutzerdefinierten Schwellenwert herausgefiltert wurden.</li>
	<li>Quantifizieren Sie den Ausdruck als Verhältnis des Teilsegments von Interesse zum Durchschnitt aller anderen Untersegmente und log2-transform. Die relative Expression desselben Gens kann über Untersegmente und Proben hinweg verglichen werden; Es ist jedoch nicht ideal, die relative Expression zwischen zwei verschiedenen Genen aufgrund möglicher Degradierungsunterschiede zwischen Genen und RNA-Arten zu vergleichen.</li>
	<li>Führen Sie eine Anreicherungsanalyse durch, um die Genexpression für eine Reihe von Herstellern zu vergleichen, die für jedes Nephron-Untersegment spezifisch sind, während Referenz-RNA-Proben über Chargen hinweg verglichen werden. Ein Batcheffekt innerhalb von 1 Standardabweichung des mittelwertigen Ausdrucks mit R-Wert > 0,9 gilt als akzeptabel. Für eine höhere Batch-Effekt-Punktzahl ist eine zusätzliche Normalisierung erforderlich. Jede Ausführung, die vom akzeptierten Batcheffekt abweicht, kann gekennzeichnet werden. Der Q30 sollte für jeden Sequenzierungslauf größer als >90 % sein.</li>
</ol>

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

LMD-basierte Transkriptomik ist eine nützliche Technologie, die die Genexpression an bestimmten Bereichen im Gewebe verankert. Die Basis dieser Technologie und ihre mögliche Anwendung in der Niere wurde zuvor beschrieben8. Die Optimierung, Modernisierung und Rationalisierung der fluoreszenzbasierten Dissektion, die speziell auf eine hochpräzise Sesektion für die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung ausgerichtet ist, ist jedoch weniger allgegenwärtig. Da diese Methode räumlich im Gewebe begründ...

Technologische Fortschritte bei der Untersuchung von Gewebeproben haben das Verständnis des Gesundheitszustands und der Krankheit in verschiedenen Organen verbessert. Solche Fortschritte haben unterstrichen, dass Pathologie in begrenzten Regionen oder in bestimmten Zelltypen beginnen kann, aber wichtige Auswirkungen auf das gesamte Organ hat. Daher ist es im gegenwärtigen Alter der personalisierten Medizin wichtig, die Biologie sowohl auf Zell- als auch auf regionaler Ebene zu verstehen und nicht nur weltweit1. Dies gilt insbesondere für die Niere, die aus verschiedenen spezialisierten Zellen und Strukturen besteht, die differenziell pathologischen Stress initiieren und/oder darauf reagieren. Die Pathogenese verschiedener Arten menschlicher Nierenerkrankungen ist noch immer nicht gut verstanden. Die Generierung einer Methodik zur Untersuchung von Veränderungen der Genexpression in bestimmten röhrenförmigen Segmenten, Strukturen oder Bereichen des Interstitiums in der menschlichen Niere wird die Fähigkeit verbessern, regionale spezifische Veränderungen aufzudecken, die über die Pathogenese von Krankheiten informieren könnten.
Menschliche Nierenbiopsie-Proben sind eine begrenzte und wertvolle Ressource. Daher sollten Technologien, die Transkriptomik im Nierengewebe verhören, optimiert werden, um Gewebe zu sparen. Zu den verfügbaren Methoden zur Untersuchung der Transkriptomik auf Zell- und Regionaler Ebene gehören die einzellige RNA-Sequenzierung (scRNaseq), die einzelne kernatoische RNaseq (snRNaseq), die räumliche In-situ-Hybridisierung und die Lasermikrodissektion (LMD). Letzteres eignet sich gut für die präzise Isolierung von Regionen oder Strukturen von Interesse innerhalb von Gewebeabschnitten, für die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung und -Analyse2,3,4,5. LMD kann angenommen werden, um sich auf die Identifizierung bestimmter Zelltypen oder Strukturen basierend auf validierten Markern zu verlassen, die fluoreszenzbasierte Bildgebung während der Zerlegung verwenden.
Zu den einzigartigen Merkmalen der lasermikrodissektionengestützten regionalen Transkriptomik gehören: 1) die Erhaltung des räumlichen Kontextes von Zellen und Strukturen, die Einzelzelltechnologien ergänzt, bei denen Zellen durch Expression und nicht durch Histologie identifiziert werden; 2) die Technologie informiert und wird durch andere Bildgebungstechnologien informiert, weil ein Antikörpermarker Ausdruckssignaturen definiert; 3) die Fähigkeit, Strukturen zu identifizieren, auch wenn sich Marker in Derkrankheit ändern; 4) Nachweis von niedrig exprimierenden Transkripten in etwa 20.000 Genen; und 5) bemerkenswerte Gewebewirtschaft. Die Technologie ist skalierbar für eine Nierenbiopsie mit einer Dicke von weniger als 100 m eines Kerns, der für eine ausreichende RNA-Erfassung notwendig ist, und ermöglicht die Verwendung von archiviertem gefrorenem Gewebe, das in großen Repositories oder akademischen Zentren allgemein verfügbar ist6.
In der anschließenden Arbeit beschreiben wir die regionale und Massen-Transkriptomik-Technologie im Detail, optimiert mit einem neuartigen schnellen Fluoreszenz-Färbeprotokoll für die Verwendung mit menschlichem Nierengewebe. Dieser Ansatz verbessert die klassischen LMD-Explorationen, da er separate Ausdrucksdaten für die Interstitium- und Nephron-Untersegmente im Gegensatz zu aggregierter tubulointerstitialer Expression bereitstellt. Dazu gehören die Qualitätssicherungs- und Kontrollmaßnahmen, die zur Gewährleistung von Strenge und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Das Protokoll ermöglicht die Visualisierung von Zellen und Interessensgebieten, was zu einer zufriedenstellenden Erfassung von RNA aus diesen isolierten Bereichen führt, um eine nachgeschaltete RNA-Sequenzierung zu ermöglichen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

Die Genexpressionsanalyse des menschlichen Nierengewebes ist ein wichtiges Werkzeug, um Homöostase und Krankheitspathophysiologie zu verstehen. Es ist notwendig, die Auflösung und Tiefe dieser Technologie zu erhöhen und sie auf die Ebene der Zellen im Gewebe auszudehnen. Obwohl die Verwendung von einzelnuklearen und einzelzelligen RNA-Sequenzierungen weit verbreitet ist, behalten die Expressionssignaturen von Zellen, die aus der Gewebedissoziation gewonnen werden, keinen räumlichen Kontext bei. Lasermikrodissektion (LMD) auf Basis spezifischer fluoreszierender Marker würde die Isolierung spezifischer Strukturen und Zellgruppen von Interesse mit bekannter Lokalisierung ermöglichen und so den Erwerb von räumlich verankerten transkriptomischen Signaturen im Nierengewebe ermöglichen. Wir haben eine LMD-Methodik optimiert, die von einem schnellen fluoreszenzbasierten Fleck geleitet wird, um fünf verschiedene Kompartimente innerhalb der menschlichen Niere zu isolieren und anschließende RNA-Sequenzierungen von wertvollen menschlichen Nierengewebeproben durchzuführen. Wir stellen auch Qualitätskontrollparameter vor, um die Angemessenheit der gesammelten Proben beurteilen zu können. Der in diesem Manuskript beschriebene Workflow zeigt die Durchführbarkeit dieses Ansatzes, subsegmentale transkriptomische Signaturen mit hoher Sicherheit zu isolieren. Der hier vorgestellte methodische Ansatz kann auch auf andere Gewebetypen mit Substitution relevanter Antikörpermarker angewendet werden.

Proben
Wir präsentieren Daten von neun Referenznephrektomien (3 Proben, die an der Indiana University gewonnen wurden, und 6 Proben, die durch das Kidney Precision Medicine Project gewonnen wurden), wobei das schnelle Fluoreszenz-Färbeprotokoll verwendet wird, um Nierennephronsegmente und interstitielle Bereiche zu isolieren. Die in diesem Prozess verwendeten Abschnitte wurden von verstorbenen Nierenspendern oder nicht betroffenen Tumornephrectomien gewonnen. Diese Proben ha...

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Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Wir beschreiben ein Protokoll für die Lasermikrodissektion von Untersegmenten der menschlichen Niere, einschließlich des Glomerulus, proximalen Tubuli, dick aufsteigender Gliedmaße, Sammelkanal und Interstitium. Die RNA wird dann aus den erhaltenen Kompartimenten isoliert und die RNA-Sequenzierung wird durchgeführt, um Veränderungen in der transkriptomischen Signatur innerhalb jedes Teilsegments zu bestimmen.

Anwendung der Laser-Mikrodissektion zur Aufdeckung der regionalen Transkriptomik im menschlichen Nierengewebe

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

application-laser-microdissection-to-uncover-regional-transcriptomics

Research

JoVE Journal

Biology

3.8K Aufrufe.  Indiana University School of Medicine. Wir beschreiben ein Protokoll für die Lasermikrodissektion von Untersegmenten der menschlichen Niere, einschließlich des Glomerulus, proximalen Tubuli, dick aufsteigender Gliedmaße, Sammelkanal und Interstitium. Die RNA wird dann aus den erhaltenen Kompartimenten isoliert und die RNA-Sequenzierung wird durchgeführt, um Veränderungen in der transkriptomischen Signatur innerhalb jedes Teilsegments zu bestimmen.

Serie: Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Forschung

Biologie

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Laser Mikrodissektion Angewandt auf Gene Expression Profiling von Untergruppe von Zellen aus dem Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Lasergestützte Mikrodissektion (LAM) als Werkzeug für die Transkriptionsprofilierung einzelner Zelltypen

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Laser Capture Microdissection von hochreinen trabekuläre Geflecht aus Maus Augen für Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Ein Laser Capture Microdissection Protocol, das hochwertige RNA aus frisch gefrorenen Mausknochen liefert

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequenzierung für räumliche und zeitliche gewebespezifische Genexpressionsanalyse in Pflanzen

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high efficiency. Normal kidney tubuloids recapitulate many aspects of their tissue of origin. They represent distinct nephron segments - most notably of the proximal tubule, loop of Henle, distal tubules, and collecting duct - and can be used to study normal kidney physiology. Furthermore, tubuloid technology facilitates disease modeling, e.g., for infectious diseases as well as for cancer. Obtaining kidney epithelial cells for tubuloid generation is, however, dependent on leftover surgical material (such as partial) nephrectomies) or needle biopsies. The ability to grow tubuloids from urine would provide an alternative, less invasive source of healthy kidney epithelial cells. It has been previously shown that tubuloid cultures can be successfully generated from only a few milliliters of freshly collected urine. This article describes the protocols to generate and propagate ASC-derived human kidney tubuloid cultures from tissue and urine samples.

Human kidney tubuloid cultures represent a valuable in vitro model to study kidney physiology and disease. Tubuloids can be established from kidney tissue (healthy and diseased) as well as urine, the latter representing an easily obtainable and less invasive source of research material.

Erzeugung von menschlichen Nierentubuliden aus Gewebe und Urin

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Laser-Mikrodissektion für speziesunabhängige Einzelgewebeanwendungen

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...