Général: Les auteurs remercient les chercheurs du Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) pour leur soutien et leurs conseils gracieux.
Financement : Le soutien à ces travaux a été fourni par les NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (S.T.A.). Les recherches rapportées dans ce manuscrit ont été soutenues par le National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), sous le numéro de prix U2CDK114886.
Disponibilité des données et des matériaux : Les données sont archivées dans le Gene Expression Omnibus (GEO # en attente)

L’étude a été approuvée pour utilisation par l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université de l’Indiana.
REMARQUE : Utilisez ce protocole avec du tissu néphrectomie rénale (jusqu’à 2 cm dans les dimensions X et Y) conservé dans le composé de la température optimale de coupe (OCT) et stocké à -80 °C. Effectuez tous les travaux d’une manière qui limite la contamination par l’ARN, utilisez des gants jetables propres et un masque facial. Assurer la propreté de toutes les surfaces. L’équipement pour lequel ce protocole a été optimisé est un système de microdissection laser doté d’un laser UV pulsé.
1. Cryosection
<ol><li>Exposer 1,2 μm LMD PPS-membrane (poly(p-phenylene sulfure) glisse à la lumière UV (dans une culture tissulaire capuchon d’écoulement laminaire) pendant 30 minutes, immédiatement avant la cryosection. Rangez les glissières à température ambiante pour une adhérence optimale des tissus.</li>
	<li>Laisser refroidir le cryostat à -20 °C. Nettoyez les surfaces de travail et installez une nouvelle lame de coupe.</li>
	<li>Placez une petite boîte à glissière (nettoyée avec la solution de décontamination de surface RNase) à l’intérieur de la chambre cryostat pour stocker les glissières avec du tissu fraîchement coupé.</li>
	<li>Adhérez l’échantillon en OCT à un porte-tissus et laissez-le équilibrer pendant quelques minutes pour atteindre la température de la chambre et renforcer l’adhérence entre le bloc OCT et le support. Faciliter le processus à l’aide d’un extracteur de chaleur.</li>
	<li>Coupez l’échantillon à une épaisseur de 12 μm et fixez-le à la diapositive LMD spécialisée, à l’aide de l’adaptateur de diapositives. Chaque diapositive contient une section de néphrectomie par toboggan ou jusqu’à deux sections de biopsie rénale par diapositive. Rangez les glissières à -80 °C à l’aide d’une cartouche de dessiccant et à l’intérieur d’un sac en plastique bien fermé pour éviter que l’excès d’humidité ne s’accumule à l’intérieur de la boîte à glissière.</li>
	<li>Étiquetez chaque diapositive avec un iD de spécimen, une date et un numéro de diapositive.</li>
	<li>Utilisez les diapositives avec des spécimens dans les 10 jours suivant la date initiale de cryosection.</li>
</ol>2. Microdissection laser
<ol><li>Immédiatement avant la coloration, préparer le mélange anticorps (Ab-Mix) en 10% BSA en PBS sans RNase en ajoutant ce qui suit: 4 μL de FITC-Phalloidin, 1,5 μL de DAPI, 2 μL d’anticorps tamm-horsfall protein (THP) directement conjugués à Alexa Fluor 546, 3,3 μL d’inhibiteur de la RNase et 89,2 μL de 10 % de BSA en PBS (pour atteindre un volume de 100 μL). REMARQUE : Des anticorps alternatifs peuvent être utilisés à la place de l’anticorps THP. Par exemple, 2 μL d’anticorps mégalin/LRP2, directement conjugués à Alexa Fluor 568, peuvent être utilisés pour étiqueter le tubule proximal. L’Ab-Mix contient des anticorps LRP2 ou THP (pour visualiser les tubules proximaux ou les membres ascendants épais, respectivement). D’autres anticorps peuvent être validés en fonction des besoins de l’utilisateur.</li>
	<li>Laver la glissade dans le froid glacial (-20 °C) 100 % d’acétone pendant 1 min et la déplacer dans la chambre d’humidité.</li>
	<li>Laver le haut de la diapositive avec du PBS sans RNase pendant 30 s. Répéter.</li>
	<li>Lavez le haut de la diapositive avec 10% BSA en PBS sans RNase pendant 30 s. Répétez.</li>
	<li>Appliquer l’Ab-Mix pendant 5 min.</li>
	<li>Lavez le haut de la diapositive avec 10% BSA en PBS sans RNase pendant 30 s. Répétez.</li>
	<li>Séchez la glissière pendant 5 min et chargez-la sur la plate-forme de coupe de microdissection laser.</li>
	<li>Installez les tubes de collecte (tubes de microcentrifugeuses autoclavés de 0,5 mL) appropriés pour le travail pcr, contenant 50 μL de tampon d’extraction du kit d’isolation arn.</li>
	<li>Procédez avec LMD. Terminez chaque session LMD dans un délai maximum de 2 heures.<ol>
<li>Recueillir des images d’immunofluorescence avant et après la LMD, à l’aide de la caméra microscope pour valider la dissection pour la variabilité entre opérateurs ainsi qu’à des fins archivistiques, formation et évaluation de la qualité du protocole effectué. Afin d’obtenir 0,5 à 1 ng d’ARN, un minimum de 500 000 μm2 est nécessaire. Cela nécessite souvent l’utilisation de sections jusqu’à 8 x 12 μm d’épaisseur pour obtenir une quantité suffisante de matériaux pour tous les sous-segments d’intérêt.</li>
		<li>Identifiez les régions d’intérêt en les soudant, en les morphologie et en les acciseant à l’aide d’une puissance laser supérieure à 40. REMARQUE : Voici les critères de dissection. Le tubule proximal est défini par l’étiquetage FITC-Phalloidin et LRP2. Le membre ascendant épais est défini par l’étiquetage THP. Le conduit de collecte est défini par la morphologie nucléaire (DAPI) et l’absence d’autres taches. Le glomerulus est défini par fitc-phalloidin et morphologie. L’interstitium est défini comme la zone entre les tubules tachés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Obtenez une signature d’expression transversale en vrac en apposant deux sections de 12 μm sur une diapositive LMD et en disséquant les sections entières en tampon d’extraction.</li>
	<li>À la fin du processus LMD, fermez les tubes de microcentrifugeuse de collecte et faites-le glisser vigoureusement pour vous assurer que le contenu se déplaçait du bouchon vers le bas du tube.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 3 000 x g pendant 30 s.</li>
	<li>Incuber les tubes dans un bain d’eau de 42 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 3 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 0,5 mL et le conserver en -80 °C.</li>
</ol>3. Isolement d’ARN
REMARQUE : Pour ce protocole d’isolement de l’ARN, nous avons adapté un protocole à partir d’une trousse commerciale d’isolement de l’ARN. Le protocole du fabricant a été modifié pour répondre aux exigences de contrôle de la qualité fixées pour le projet.
<ol><li>Ajouter 250 μL de tampon conditionné (CB) à chaque colonne de purification de l’ARN (PC) et incuber pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifugeuse tous les PC pendant 1 min à 16.000 x g.</li>
	<li>Ajouter 50 μL d’éthanol à 70 % (fourni dans le kit) dans les tubes avec des échantillons de tissus. Bien mélanger les échantillons en faisant des tuyaux de haut en bas. Ne pas vortex. Ne pas centrifugeuse.</li>
	<li>Transférer le mélange dans des PC conditionnés et une centrifugeuse pendant 2 min à 100 x g (pour lier l’ARN), suivre rapidement avec centrifugation pendant 30 s à 16.000 x g (pour enlever le flux à travers). Répétez cette étape si plus d’un tube avec des échantillons de tissus sont disponibles pour un sous-segment donné.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de Wash Buffer 1 (WB1) dans les PC et la centrifugeuse pendant 1 minute à 8 000 x g.</li>
	<li>Préparer 40 μL de DNase par échantillon (Ajouter 5 μL de DNase à 35 μL de tampon RDD). Ajouter ensuite 40 μL du mélange directement sur la membrane du PC et incuber pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 40 μL de WB1 sur la membrane du PC et une centrifugeuse de 15 s à 8 000 x g.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de Wash Buffer 2 (WB2) sur la membrane du PC, et centrifugeuse pendant 1 min à 8 000 x g.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de WB2 sur la membrane du PC, centrifugeuse pendant 2 min à 16 000 x g,suivre immédiatement par centrifugation pendant 1 min à 16 000 x g.</li>
	<li>Transférez le PC dans un nouveau tube de 0,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 12 μL d’Elution Buffer (EB) sur la membrane et incuber pendant 7 min à température ambiante. Ainsi, le volume final de tous les échantillons de tissus disséqués mis en commun est de 12 μL par sous-segment.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons pendant 1 min à 1000 x g, puis pendant 2 min à 16 000 x g.</li>
	<li>Transférer 2 μL dans un tube frais pour l’analyse bioanalyse (pour éviter les événements de gel-dégel).</li>
	<li>Conserver tous les tubes en -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour un traitement ultérieur.</li>
</ol>4. Séquençage de l’ARN
<ol><li>Évaluer chaque échantillon, destiné au séquençage, pour la qualité à l’aide d’un bioanalyseur commercial et d’une puce dédiée à la mesure de petites quantités d’ARN.</li>
	<li>Il faut suivre les paramètres de contrôle de la qualité (QC) avant la préparation et le séquençage de la bibliothèque : quantité d’ARN supérieure à 4 ng en vrac et supérieure à 0,5 à 1 ng pour chaque sous-segment; Le pourcentage de transcriptions de plus de 200 nucléotides (DV200) doit être supérieur à 25 % pour les échantillons de LMD (optimal > 75 %).</li>
	<li>Effectuer la préparation de la bibliothèque avec une trousse commerciale de préparation de la bibliothèque cDNA destinée à de petites quantités d’ARN dégradé. Pour le kit commercial énuméré dans le supplément, nous vous suggérons d’utiliser l’option 2, qui nécessite un minimum de DV200 de 25% et pas de fragmentation. Certaines technologies de séquençage peuvent nécessiter des seuils de DV200 minimaux plus élevés, tels que 30% 7.</li>
	<li>Ajoutez des adaptateurs et des index cDNA.</li>
	<li>Purifiez les bibliothèques RNAseq à l’aide de la technologie des perles magnétiques.</li>
	<li>Épuisez l’ADND ribosomal à l’aide d’un kit commercial d’enlèvement rRNA avant l’étape d’amplification de la bibliothèque RNAseq.</li>
	<li>Purifier la bibliothèque finale du RNAseq à l’aide de la technologie des perles magnétiques à une concentration de bibliothèque cDNA de 2 ng/μL.</li>
	<li>Effectuer le séquençage de l’ARN de 75 pb sur un système de séquençage commercial avec 30 millions de lecture/échantillon pour le vrac et 100 millions de lecture/échantillon pour les sections sous-segmentales.</li>
	<li>Utilisez un ARN de référence (25 μg) à chaque course de séquençage pour permettre le contrôle de l’effet de lot. La concentration initiale de notre ARN de référence est de 1 μg/μL, tandis que la concentration finale utilisée dans le séquençage est de 25 ng/μL. Exécutez l’ARN de référence comme un échantillon distinct pendant la préparation de la bibliothèque et courez avec tous les spécimens de LMD à chaque fois.</li>
	<li>Effectuer une analyse des données à l’aide de l’application FastQC pour évaluer la qualité des lectures séquençantes, intergéniques et mitochondriales et pour déterminer les lectures attribuées à un gène.</li>
	<li>Utilisez Integrative Genomics Viewer (IGV) pour l’alignement et edgeR/rbamtools pour les mesures d’expression de transcription.</li>
	<li>Retirez les échantillons avec moins de 100 000 lectures. Quantile normalise les lectures brutes dans l’ensemble de données après le filtrage des gènes faiblement exprimés à un seuil défini par l’utilisateur.</li>
	<li>Quantifier l’expression comme un rapport entre le sous-segment d’intérêt et la moyenne de tous les autres sous-segments et log2-transform. L’expression relative du même gène peut être comparée entre les sous-segments et les échantillons; cependant, il n’est pas idéal de comparer l’expression relative entre deux gènes différents en raison de différences potentielles de dégradation entre les gènes et les espèces d’ARN.</li>
	<li>Effectuer une analyse d’enrichissement pour comparer l’expression des gènes pour un ensemble de fabricants spécifiques à chaque sous-segment du néphron, tandis que les échantillons d’ARN de référence sont comparés entre lots. Un effet de lot dans un écart type de l’expression moyenne avec valeur R > 0,9 est considéré comme acceptable. Une normalisation supplémentaire est nécessaire pour un score d’effet de lot plus élevé. Toute course qui s’écarte de l’effet de lot accepté peut être signalée. Le Q30 devrait être supérieur à >90% pour chaque course de séquençage.</li>
</ol>

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La transcriptomics basée sur le LMD est une technologie utile qui ancre l’expression des gènes dans des zones spécifiques du tissu. La base de cette technologie et son application potentielle dans le rein a été décrite précédemment8. Toutefois, l’optimisation, la modernisation et la rationalisation de la dissection basée sur la fluorescence visant spécifiquement à une dissection de haute précision pour le séquençage de l’ARN en aval sont moins omniprésentes. Parce que cette m?...

Les progrès technologiques dans l’étude des échantillons de tissus ont amélioré la compréhension de l’état de santé et de la maladie dans divers organes. Ces progrès ont souligné que la pathologie peut commencer dans des régions limitées ou dans des types de cellules spécifiques, mais ont des implications importantes sur l’ensemble de l’organe. Par conséquent, à l’ère actuelle de la médecine personnalisée, il est important de comprendre la biologie à la fois au niveau cellulaire et régional et pas seulement globalement1. Cela est particulièrement vrai dans le rein, qui est composé de diverses cellules et structures spécialisées qui initient et/ou répondent différemment au stress pathologique. La pathogénie de divers types de maladie rénale humaine n’est toujours pas bien comprise. La génération d’une méthodologie pour étudier les changements dans l’expression des gènes dans des segments tubulaires spécifiques, des structures ou des zones de l’interstitium dans le rein humain améliorera la capacité de découvrir des changements spécifiques à la région qui pourraient éclairer sur la pathogénie de la maladie.
Les spécimens humains de biopsie rénale sont une ressource limitée et précieuse. Par conséquent, les technologies interrogeant la transcriptomique dans le tissu rénal devraient être optimisées pour économiser les tissus. Les méthodes disponibles pour étudier la transcriptomique au niveau cellulaire et régional comprennent le séquençage de l’ARN à cellule unique (scRNaseq), le RNaseq nucléaire unique (snRNaseq), l’hybridation spatiale in situ et la microdissection laser (LMD). Ce dernier est bien adapté à l’isolement précis des régions ou des structures d’intérêt dans les sections tissulaires, pour le séquençage et l’analyse del’ARN en aval 2,3,4,5. LMD peut être adopté pour s’appuyer sur l’identification de types ou de structures cellulaires spécifiques basés sur des marqueurs validés utilisant l’imagerie basée sur la fluorescence pendant la dissection.
Les caractéristiques uniques de la transcriptomics régionale assistée par microdissection laser comprennent : 1) la préservation du contexte spatial des cellules et des structures, qui complète les technologies cellulaires uniques où les cellules sont identifiées par expression plutôt qu’histologiquement; 2) la technologie informe et est informée par d’autres technologies d’imagerie parce qu’un marqueur d’anticorps définit des signatures d’expression ; 3) la capacité d’identifier les structures même lorsque les marqueurs changent dans la maladie; 4) détection de transcriptions faiblement exprimées dans environ 20 000 gènes; et 5) économie remarquable des tissus. La technologie est évolutive à une biopsie rénale avec moins de 100 μm d’épaisseur d’un noyau nécessaire à l’acquisition suffisante d’ARN et permet l’utilisation de tissus congelés archivés, qui sont couramment disponibles dans les grands dépôts ou centres universitaires6.
Dans les travaux qui ont suivi, nous décrivons en détail la technologie de transcriptomics régionale et en vrac, optimisée avec un nouveau protocole rapide de coloration par fluorescence pour une utilisation avec le tissu rénal humain. Cette approche améliore les explorations classiques du LMD parce qu’elle fournit des données d’expression distinctes pour les sous-segments interstitium et néphron par opposition à l’expression tubulointerstitial globale. On y inclut les mesures d’assurance et de contrôle de la qualité mises en œuvre pour assurer la rigueur et la reproductibilité. Le protocole permet la visualisation des cellules et des régions d’intérêt, ce qui se traduit par l’acquisition satisfaisante de l’ARN de ces zones isolées pour permettre le séquençage de l’ARN en aval.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

L’analyse de l’expression génétique du tissu rénal humain est un outil important pour comprendre l’homéostasie et la pathophysiologie des maladies. Il est nécessaire d’augmenter la résolution et la profondeur de cette technologie et de l’étendre au niveau des cellules dans le tissu. Bien que l’utilisation du séquençage d’ARN nucléaire et unicelliste unique soit devenue répandue, les signatures d’expression des cellules obtenues de la dissociation tissulaire ne maintiennent pas le contexte spatial. La microdissection laser (LMD) basée sur des marqueurs fluorescents spécifiques permettrait l’isolement de structures spécifiques et de groupes cellulaires d’intérêt avec localisation connue, permettant ainsi l’acquisition de signatures transcriptomiques ancrées spatialement dans le tissu rénal. Nous avons optimisé une méthodologie de LMD, guidée par une tache basée sur la fluorescence rapide, pour isoler cinq compartiments distincts dans le rein humain et mener le séquençage ultérieur d’ARN des spécimens humains précieux de tissu de rein. Nous présentons également des paramètres de contrôle de la qualité pour permettre l’évaluation de l’adéquation des spécimens recueillis. Le flux de travail décrit dans ce manuscrit montre la faisabilité de cette approche pour isoler les signatures transcriptomiques sous-segmentales avec une grande confiance. L’approche méthodologique présentée ici peut également être appliquée à d’autres types de tissus avec substitution de marqueurs anticorps pertinents.

Échantillons
Nous présentons des données provenant de neuf néphrectomies de référence (3 spécimens obtenus à l’Université de l’Indiana et 6 spécimens obtenus dans le cadre du Kidney Precision Medicine Project), en utilisant le protocole de coloration par fluorescence rapide pour isoler les segments de néphron rénal et les zones interstitielles. Les sections utilisées dans ce processus ont été obtenues des donneurs de rein décédés ou des nephrectomies non ...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Nous décrivons un protocole pour la microdissection laser des sous-segments du rein humain, y compris le glomerulus, le tubule proximal, le membre ascendant épais, le conduit de collecte et l’interstitium. L’ARN est ensuite isolé des compartiments obtenus et le séquençage de l’ARN est effectué pour déterminer les changements dans la signature transcriptomique dans chaque sous-segment.

Application de la microdissection laser pour découvrir la transcriptomics régionale dans le tissu rénal humain

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

application-laser-microdissection-to-uncover-regional-transcriptomics

Research

JoVE Journal

Biology

3.8K vues.  Indiana University School of Medicine. Nous décrivons un protocole pour la microdissection laser des sous-segments du rein humain, y compris le glomerulus, le tubule proximal, le membre ascendant épais, le conduit de collecte et l’interstitium. L’ARN est ensuite isolé des compartiments obtenus et le séquençage de l’ARN est effectué pour déterminer les changements dans la signature transcriptomique dans chaque sous-segment.

Vidéo: Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Microdissection laser des tissus de mammifères

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Recherche

Biologie

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Microdissection laser appliquée au profil d&#39;expression génique de la Sous-ensemble de cellules provenant de la Drosophile Wing disque

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

Isolement de l&#39;ARN à partir de sous-populations cellulaires spécifiques en utilisant le laser capture microdissection Combiné avec Rapid immunomarquage

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

assistée par laser microdissection (LAM) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La perfusé Technique du rein de souris isolé

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Saisie Microdissection de trabéculum très Pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’Expression génique

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Un protocole de microdissection de capture de laser qui donne l'ARN de haute qualité des os frais-congelés de souris

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Analyse de l’ARN de microdissection à capture laser pour analyse d’expression génique spécifique aux tissus spatiaux et temporels chez les plantes

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high efficiency. Normal kidney tubuloids recapitulate many aspects of their tissue of origin. They represent distinct nephron segments - most notably of the proximal tubule, loop of Henle, distal tubules, and collecting duct - and can be used to study normal kidney physiology. Furthermore, tubuloid technology facilitates disease modeling, e.g., for infectious diseases as well as for cancer. Obtaining kidney epithelial cells for tubuloid generation is, however, dependent on leftover surgical material (such as partial) nephrectomies) or needle biopsies. The ability to grow tubuloids from urine would provide an alternative, less invasive source of healthy kidney epithelial cells. It has been previously shown that tubuloid cultures can be successfully generated from only a few milliliters of freshly collected urine. This article describes the protocols to generate and propagate ASC-derived human kidney tubuloid cultures from tissue and urine samples.

Human kidney tubuloid cultures represent a valuable in vitro model to study kidney physiology and disease. Tubuloids can be established from kidney tissue (healthy and diseased) as well as urine, the latter representing an easily obtainable and less invasive source of research material.

Génération de tubuloïdes rénaux humains à partir de tissus et d’urine

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Microdissection laser pour les applications mono-tissulaires indépendantes des espèces

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...