Generale: Gli autori ringraziano gli investigatori del Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) per il loro gentile supporto e consiglio.
Finanziamento: Il supporto per questo lavoro è stato fornito dal NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), con il numero di premio U2CDK114886.
Disponibilità di dati e materiali: I dati vengono archiviati nel Gene Expression Omnibus (GEO # in sospeso)

Lo studio è stato approvato per l'uso da parte dell'Institutional Review Board (IRB) dell'Indiana University.
NOTA: Utilizzare questo protocollo con tessuto nefromia renale (fino a 2 cm sia nelle dimensioni X che Y) conservato nel composto della temperatura di taglio ottimale (OCT) e conservato a -80 °C. Eseguire tutto il lavoro in modo da limiti la contaminazione da RNA, utilizzare guanti monouso puliti e una maschera facciale. Garantire la pulizia di tutte le superfici. L'apparecchiatura per la quale questo protocollo è stato ottimizzato è un sistema di microdisezione laser con laser UV pulsato.
1. Criosezione
<ol><li>Esporre diapositive a membrana PPS LMD da 1,2 μm (solfuro di poli(p-fenilene) alla luce UV (in una cappa di flusso laminare di coltura tissutale) per 30 minuti, immediatamente prima della criosezione. Conservare le diapositive a temperatura ambiente per un'aderenza ottimale ai tessuti.</li>
	<li>Raffreddare il criostato a -20 °C. Pulire le superfici di lavoro e installare una nuova lama da taglio.</li>
	<li>Posizionare una piccola scatola scorrevole (pulita con soluzione di decontaminazione superficiale RNasi) all'interno della camera criostatica per conservare le diapositive con tessuto appena tagliato.</li>
	<li>Aderire il campione in OCT a un porta tessuto e consentirgli di equilibrare per alcuni minuti per raggiungere la temperatura della camera e rafforzare l'adesione tra il blocco OCT e il supporto. Aiutare il processo utilizzando un estrattore di calore.</li>
	<li>Tagliare il campione a uno spessore di 12 μm e apporrlo sul vetrino LMD specializzato, utilizzando l'adattatore di scorrimento. Ogni diapositiva contiene una sezione di nefrectomia per diapositiva o fino a due sezioni di biopsia renale per diapositiva. Conservare i vetrini a -80 °C con una cartuccia essiccante e all'interno di un sacchetto di plastica ben chiuso per evitare che l'umidità in eccesso si accumuli all'interno della scatola scorrevole.</li>
	<li>Etichettare ogni diapositiva con un ID campione, una data e un numero di diapositiva.</li>
	<li>Utilizzare le diapositive con campioni entro 10 giorni dalla data iniziale della criosezione.</li>
</ol>2. Microdisezione laser
<ol><li>Immediatamente prima della colorazione, preparare la miscela di anticorpi (Ab-Mix) in BSA al 10% in PBS privo di RNasi aggiungendo quanto segue: 4 μL di FITC-Phalloidin, 1,5 μL di DAPI, 2 μL di anticorpo della proteina Tamm-Horsfall (THP) coniugati direttamente ad Alexa Fluor 546, 3,3 μL di inibitore della RNasi e 89,2 μL di 10% di BSA in PBS (per raggiungere un volume di 100 μL). NOTA: Anticorpi alternativi possono essere utilizzati al posto dell'anticorpo THP. Ad esempio, 2 μL di anticorpo megalina/LRP2, coniugato direttamente ad Alexa Fluor 568, possono essere utilizzati per etichettare il tubulo prossimale. L'Ab-Mix contiene anticorpi LRP2 o THP (per visualizzare rispettivamente tubuli prossimali o arti ascendenti spessi). Altri anticorpi possono essere convalidati in base alle esigenze dell'utente.</li>
	<li>Lavare lo scivolo in ghiaccio freddo (-20 °C) acetone al 100% per 1 minuto e spostarlo nella camera di umidità.</li>
	<li>Lavare la parte superiore della diapositiva con PBS privo di RNasi per 30 s. Ripetere.</li>
	<li>Lavare la parte superiore dello scivolo con BSA al 10% in PBS privo di RNasi per 30 s. Ripetere.</li>
	<li>Applicare l'Ab-Mix per 5 min.</li>
	<li>Lavare la parte superiore dello scivolo con BSA al 10% in PBS privo di RNasi per 30 s. Ripetere.</li>
	<li>Asciugare all'aria lo scivolo per 5 minuti e caricarlo sulla piattaforma di taglio della microdisezione laser.</li>
	<li>Installare i tubi di raccolta (tubi di microcentrifugo autoclavati da 0,5 ml) appropriati per il lavoro pcr, contenenti 50 μL di extraction buffer dal kit di isolamento dell'RNA.</li>
	<li>Procedere con LMD. Completa ogni sessione LMD entro un massimo di 2 ore.<ol>
<li>Raccogli immagini immunofluorescenza pre e post-LMD, utilizzando la fotocamera del microscopio per convalidare la dissezione per la variabilità inter-operatore, nonché scopi di archiviazione, formazione e valutazione della qualità del protocollo eseguito. Per ottenere 0,5 - 1 ng di RNA, è richiesta un'area minima di 500.000μm 2. Ciò richiede spesso l'uso di sezioni spesse fino a 8 x12 μm per ottenere una quantità sufficiente di materiale per tutti i sottoserti di interesse.</li>
		<li>Identificare le regioni di interesse macchiando, morfologia e posizione e asportandole utilizzando una potenza laser superiore a 40. NOTA: Ecco i criteri di dissezione. Il tubulo prossimale è definito dall'etichettatura FITC-Phalloidin e LRP2. L'arto ascendente spesso è definito dall'etichettatura THP. Il condotto di raccolta è definito dalla morfologia nucleare (DAPI) e dall'assenza di altre macchie. Il glomerulus è definito da FITC-Phalloidin e morfologia. L'interstizio è definito come l'area tra i tubuli macchiati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ottenere una firma di espressione di sezione trasversale di massa apporre due sezioni da 12 μm su una diapositiva LMD e sezionare le intere sezioni nel buffer di estrazione.</li>
	<li>Al termine del processo LMD, chiudere i tubi di microcentrifugo di raccolta e svolazzarlo vigorosamente per assicurarsi che il contenuto si sposti dal tappo alla parte inferiore del tubo</li>
	<li>Centrifugare i tubi a 3.000 x g per 30 s.</li>
	<li>Incubare i tubi in bagno d'acqua a 42 °C per 30 minuti.</li>
	<li>Centrifugare i tubi a 3.000 x g per 2 min.</li>
	<li>Trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 0,5 ml e conservarlo in -80 °C.</li>
</ol>3. Isolamento dell'RNA
NOTA: Per questo protocollo di isolamento dell'RNA, abbiamo adattato un protocollo da un kit di isolamento dell'RNA commerciale. Il protocollo del produttore è stato modificato per soddisfare i requisiti di controllo qualità stabiliti per il progetto.
<ol><li>Aggiungere 250 μL di Tampone condizionato (CB) a ciascuna colonna di purificazione dell'RNA (PC) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifuga tutti i PC per 1 min a 16.000 x g.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di 70% di etanolo (fornito nel kit) nei tubi con campioni di tessuto. Mescolare bene i campioni pipettando su e giù. Non vortice. Non centrifugare.</li>
	<li>Trasferire la miscela in PC condizionati e centrifugare per 2 min a 100 x g (per legare l'RNA), seguire rapidamente con centrifugazione per 30 s a 16.000 x g (per rimuovere il flusso attraverso). Ripetere questo passaggio se sono disponibili più di 1 tubo con campioni di tessuto per un determinato sottosezione.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di Wash Buffer 1 (WB1) nei PC e centrifugare per 1 minuto a 8.000 x g.</li>
	<li>Preparare 40 μL di DNasi per ogni campione (aggiungere 5 μL di DNA a 35 μL di tampone RDD). Quindi aggiungere 40 μL della miscela direttamente sulla membrana del PC e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 40 μL di WB1 sulla membrana del PC e centrifugare per 15 s a 8.000 x g.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di Wash Buffer 2 (WB2) sulla membrana del PC e centrifugare per 1 min a 8.000 x g.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di WB2 sulla membrana del PC, centrifugare per 2 min a 16.000 x g,seguire immediatamente per centrifugazione per 1 min a 16.000 x g.</li>
	<li>Trasferire il PC su un nuovo tubo da 0,5 ml.</li>
	<li>Aggiungere 12 μL di Elution Buffer (EB) sulla membrana e incubare per 7 minuti a temperatura ambiente. Pertanto, il volume finale di tutti i campioni di tessuto sezionato raggruppati è di 12 μL per sottoseme.</li>
	<li>Centrifugare i campioni per 1 min a 1.000 x g e quindi per 2 minuti a 16.000 x g.</li>
	<li>Trasferire 2 μL in un tubo fresco per l'analisi del bioanalyzer (per prevenire eventi di congelamento-disgelo).</li>
	<li>Conservare tutti i tubi a -80 °C fino a quando non sono pronti per un'ulteriore lavorazione.</li>
</ol>4. Sequenziamento dell'RNA
<ol><li>Valutare ogni campione, destinato al sequenziamento, per la qualità utilizzando un Bioanalyzer commerciale e un chip dedicato alla misurazione di piccole quantità di RNA.</li>
	<li>Sono necessari seguenti parametri di controllo qualità (QC) prima della preparazione e del sequenziamento della libreria: quantità di RNA maggiore di 4 ng per la massa e maggiore di 0,5 - 1 ng per ogni sottosezione; La percentuale di trascrizioni più lunghe di 200 nucleotidi (DV200) deve essere superiore al 25% per i campioni LMD (ottimale > 75%).</li>
	<li>Eseguire la preparazione della biblioteca con un kit di preparazione della libreria cDNA commerciale destinato a piccole quantità di RNA degradato. Per il kit commerciale elencato nel supplemento, si consiglia di utilizzare l'opzione 2, che richiede un DV200 minimo del 25% e nessuna frammentazione. Alcune tecnologie di sequenziamento potrebbero richiedere soglie DV200 minime più elevate, ad esempio il 30%7.</li>
	<li>Aggiungere adattatori e indici cDNA.</li>
	<li>Purificare le librerie RNAseq utilizzando la tecnologia delle perline magnetiche.</li>
	<li>Esaurire il cDNA ribosomiale utilizzando un kit di rimozione dell'rRNA commerciale prima della fase di amplificazione della libreria RNAseq.</li>
	<li>Purificare l'ultima libreria RNAseq utilizzando la tecnologia delle perline magnetiche a una concentrazione di libreria cDNA da 2 ng/μL.</li>
	<li>Effettuare il sequenziamento dell'RNA di 75 bp abbinato su un sistema di sequenziamento commerciale con 30 milioni di letture/campioni per la massa e 100 milioni di letture/campioni per le sezioni sottoserticate.</li>
	<li>Utilizzare un RNA di riferimento (25 μg) ad ogni corsa di sequenziamento per consentire il controllo dell'effetto batch. La concentrazione iniziale del nostro RNA di riferimento è di 1 μg/μL, mentre la concentrazione finale utilizzata nel sequenziamento è di 25 ng/μL.</li>
	<li>Eseguire l'analisi dei dati utilizzando l'applicazione FastQC per valutare la qualità delle letture sequenzianti, intergeniche e mitocondriali e per determinare le letture attribuite a un gene.</li>
	<li>Utilizzare Integrative Genomics Viewer (IGV) per l'allineamento e edgeR/rbamtools per le misure di espressione della trascrizione.</li>
	<li>Rimuovere campioni con meno di 100.000 letture. Quantile normalizza le letture grezze nel set di dati dopo aver filtrato i geni poco espressi a una soglia definita dall'utente.</li>
	<li>Quantificare l'espressione come rapporto tra il sottosezione di interesse e la media di tutti gli altri sottoserti e log2-transform. L'espressione relativa dello stesso gene può essere confrontata tra sottosemi e campioni; tuttavia, non è ideale confrontare l'espressione relativa tra due geni diversi a causa di potenziali differenze di degradazione tra geni e specie di RNA.</li>
	<li>Effettuare un'analisi di arricchimento per confrontare l'espressione genica per un insieme di produttori specifici di ogni sottosezione di nefro, mentre i campioni di RNA di riferimento vengono confrontati tra i lotti. Un effetto batch entro 1 deviazione standard dell'espressione media con valore R > 0,9 è considerato accettabile. È necessaria una normalizzazione aggiuntiva per un punteggio di effetto batch più elevato. Qualsiasi esecuzione che si discosta dall'effetto batch accettato può essere contrassegnata. Il Q30 deve essere maggiore di >90% per ogni esecuzione di sequenziamento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La trascritomica basata su LMD è una tecnologia utile che ancora l'espressione genica a aree specifiche all'interno del tessuto. La base di questa tecnologia e la sua potenziale applicazione nel rene è stata descritta in precedenza8. Tuttavia, l'ottimizzazione, la modernizzazione e la razionalizzazione della dissezione basata sulla fluorescenza specificamente finalizzata alla dissezione ad alta precisione per il sequenziamento dell'RNA a valle è meno onnipresente. Poiché questa metodologia è ...

I progressi tecnologici nello studio dei campioni di tessuto hanno migliorato la comprensione dello stato di salute e delle malattie in vari organi. Tali progressi hanno sottolineato che la patologia può iniziare in regioni limitate o in specifici tipi di cellule, ma hanno importanti implicazioni sull'intero organo. Pertanto, nell'attuale era della medicina personalizzata, è importante comprendere la biologia sia a livello cellulare che regionale e non solo a livello globale1. Ciò è particolarmente vero nel rene, che è composto da varie cellule e strutture specializzate che avviano e/o rispondono in modo differenziato allo stress patologico. La patogenesi di vari tipi di malattia renale umana non è ancora ben compresa. La generazione di una metodologia per studiare i cambiamenti nell'espressione genica in specifici segmenti tubolari, strutture o aree dell'interstizio nel rene umano migliorerà la capacità di scoprire cambiamenti specifici della regione che potrebbero informare sulla patogenesi della malattia.
Gli esemplari di biopsia renale umana sono una risorsa limitata e preziosa. Pertanto, le tecnologie che interrogano la trascritomica nel tessuto renale dovrebbero essere ottimizzate per economizzare il tessuto. I metodi disponibili per studiare la trascrittomica a livello cellulare e regionale includono il sequenziamento dell'RNA a singola cella (scRNaseq), il RNaseq nucleare singolo (snRNaseq), l'ibridazione spaziale in situ e la microdisezione laser (LMD). Quest'ultimo è adatto per un preciso isolamento di regioni o strutture di interesse all'interno di sezioni tissutali, per il sequenziamento e l'analisi dell'RNA a valle2,3,4,5. LMD può essere adottato per fare affidamento sull'identificazione di specifici tipi di cellule o strutture basate su marcatori convalidati utilizzando l'imaging a base di fluorescenza durante la dissezione.
Le caratteristiche uniche della trascrittomica regionale assistita da microdisezione laser includono: 1) la conservazione del contesto spaziale di cellule e strutture, che integra le tecnologie a singola cellula in cui le cellule sono identificate per espressione piuttosto che istologicamente; 2) la tecnologia informa ed è informata da altre tecnologie di imaging perché un marcatore anticorpale definisce le firme di espressione; 3) la capacità di identificare le strutture anche quando i marcatori cambiano nella malattia; 4) rilevazione di trascrizioni a bassa espressa in circa 20.000 geni; e 5) notevole economia tissutale. La tecnologia è scalabile a una biopsia renale con uno spessore inferiore a 100 μm di un nucleo necessario per una sufficiente acquisizione di RNA e consente l'uso di tessuti congelati archiviati, che sono comunemente disponibili in grandi depositi o centri accademici6.
Nel lavoro che ne è seguito, descriviamo in dettaglio la tecnologia trascrittamica regionale e di massa, ottimizzata con un nuovo protocollo di colorazione a fluorescenza rapida per l'uso con tessuto renale umano. Questo approccio migliora le esplorazioni LMD classiche perché fornisce dati di espressione separati per i sottoserti di interstizio e nefrone rispetto all'espressione tubulointerstiziale aggregata. Sono incluse le misure di garanzia della qualità e di controllo attuate per garantire rigore e riproducibilità. Il protocollo consente la visualizzazione di cellule e regioni di interesse, con conseguente acquisizione soddisfacente di RNA da queste aree isolate per consentire il sequenziamento dell'RNA a valle.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

L'analisi dell'espressione genica del tessuto renale umano è uno strumento importante per comprendere l'omeostasi e la fisiopatologia delle malattie. È necessario aumentare la risoluzione e la profondità di questa tecnologia ed estenderla al livello di cellule all'interno del tessuto. Sebbene l'uso del sequenziamento dell'RNA a singola e singola cellula si sia diffuso, le firme di espressione delle cellule ottenute dalla dissociazione tissutale non mantengono il contesto spaziale. La microdisezione laser (LMD) basata su specifici marcatori fluorescenti consentirebbe l'isolamento di strutture specifiche e gruppi cellulari di interesse con la localizzazione nota, consentendo così l'acquisizione di firme trascritomiche ancorate spazialmente nel tessuto renale. Abbiamo ottimizzato una metodologia LMD, guidata da una rapida macchia a base di fluorescenza, per isolare cinque compartimenti distinti all'interno del rene umano e condurre il successivo sequenziamento dell'RNA da preziosi campioni di tessuto renale umano. Presentiamo anche parametri di controllo qualità per consentire la valutazione dell'adeguatezza dei campioni raccolti. Il flusso di lavoro delineato in questo manoscritto mostra la fattibilità di questo approccio per isolare le firme trascrittimiche sottoserticate con grande fiducia. L'approccio metodologico qui presentato può essere applicato anche ad altri tipi di tessuto con sostituzione di marcatori anticorpali pertinenti.

Campioni
Presentiamo i dati di nove nefrectomie di riferimento (3 esemplari ottenuti presso l'Indiana University e 6 esemplari ottenuti attraverso Kidney Precision Medicine Project), utilizzando il protocollo di colorazione a fluorescenza rapida per isolare i segmenti di nefro renale e le aree interstiziali. Le sezioni utilizzate in questo processo sono state ottenute da donatori renali deceduti o nefrectomie tumorali non colpite. Questi campioni non hanno avuto prove patologi...

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Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Descriviamo un protocollo per la microdisezione laser di sottosezioni del rene umano, tra cui il glomerulus, il tubulo prossimale, l'arto ascendente spesso, il condotto di raccolta e l'interstizio. L'RNA viene quindi isolato dai compartimenti ottenuti e il sequenziamento dell'RNA viene effettuato per determinare i cambiamenti nella firma trascrittamica all'interno di ogni sottoseme.

Applicazione della microdisezione laser per scoprire la trascritomica regionale nel tessuto renale umano

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

3.8K Views.  Indiana University School of Medicine. Descriviamo un protocollo per la microdisezione laser di sottosezioni del rene umano, tra cui il glomerulus, il tubulo prossimale, l'arto ascendente spesso, il condotto di raccolta e l'interstizio. L'RNA viene quindi isolato dai compartimenti ottenuti e il sequenziamento dell'RNA viene effettuato per determinare i cambiamenti nella firma trascrittamica all'interno di ogni sottoseme.

Video: Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Laser Microdissezione Cattura di tessuti di mammiferi

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

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Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Microdissezione laser applicata a profili di espressione genica di sottogruppo di cellule dal Drosophila Ala Disco

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

RNA isolamento da cellulari sottopopolazioni specifiche utilizzando laser-capture Microdissection combinazione con Rapid immunomarcatura

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Laser-assistita Microdissection (LAM) come strumento per trascrizionale Profiling di tipi di cellule individuali

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La tecnica del rene perfusi mouse isolato

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Microdissezione laser di elevata purezza trabecolato dai Mouse occhi per analisi dell'espressione genica

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Un protocollo di microdissezione di cattura laser che produce RNA di alta qualità da ossa di mouse fresh-congelate

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Microsezione laser-cattura RNA-Sequenziamento per l'analisi dell'espressione genica spaziale e temporale specifica del tessuto nelle piante

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high efficiency. Normal kidney tubuloids recapitulate many aspects of their tissue of origin. They represent distinct nephron segments - most notably of the proximal tubule, loop of Henle, distal tubules, and collecting duct - and can be used to study normal kidney physiology. Furthermore, tubuloid technology facilitates disease modeling, e.g., for infectious diseases as well as for cancer. Obtaining kidney epithelial cells for tubuloid generation is, however, dependent on leftover surgical material (such as partial) nephrectomies) or needle biopsies. The ability to grow tubuloids from urine would provide an alternative, less invasive source of healthy kidney epithelial cells. It has been previously shown that tubuloid cultures can be successfully generated from only a few milliliters of freshly collected urine. This article describes the protocols to generate and propagate ASC-derived human kidney tubuloid cultures from tissue and urine samples.

Human kidney tubuloid cultures represent a valuable in vitro model to study kidney physiology and disease. Tubuloids can be established from kidney tissue (healthy and diseased) as well as urine, the latter representing an easily obtainable and less invasive source of research material.

Generazione di tubuloidi renali umani da tessuti e urine

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Microdissezione laser per applicazioni a tessuto singolo indipendenti dalla specie

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...