一般的な: 著者らは、腎臓精密医療プロジェクト(www.kpmp.org)の研究者の優雅な支援とアドバイスに感謝したいと考えています。
資金調達: この作業のサポートは、NIH/NIDDK K08DK107864(M.T.E.)によって提供されました。NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M E., P.C.D.);R01DK099345 (T.A.S.)。この原稿で報告された研究は、国立糖尿病・消化器病研究所と腎臓病研究所(NIDDK)腎臓精密医療プロジェクト(KPMP)(kpMP)(www.kpmp.org)によって、賞番号U2CDK114886の下で支援されました。
データと材料の可用性: データは遺伝子発現オムニバス(GEO #保留中)にアーカイブされます。

この研究は、インディアナ大学の機関審査委員会(IRB)によって使用が承認されました。
注:最適な切断温度(OCT)化合物に保存され、-80°Cで保存されている腎臓腎切開組織(XおよびY次元の両方で最大2 cm)でこのプロトコルを使用してください。 RNA汚染を制限する方法ですべての作業を実行し、きれいな使い捨て手袋とフェイスマスクを使用してください。すべての表面の清潔さを確認します。このプロトコルが最適化された装置は、パルスUVレーザーを搭載したレーザーマイクロ解剖システムです。
1. クライオセクション
<ol><li>1.2 μm LMD PPS膜(ポリ(p-フェニレンスルフィド)は、凍結切断の直前にUV光(組織培養層流れフード)に30分間スライドします。最適な組織付着のために、スライドを室温で保管してください。</li>
	<li>クライオスタットを-20°Cに冷却します。 作業面を清掃し、新しい切断ブレードを取り付けます。</li>
	<li>小さなスライドボックス(RNase表面除染液で洗浄)をクライオスタットチャンバーの中に置き、切りたてのティッシュでスライドを保存します。</li>
	<li>組織ホルダーにOCTで標本を付着し、チャンバー温度に達するために数分間平衡化し、OCTブロックとホルダーの間の接着を強化します。熱抽出器を使用してプロセスを支援します。</li>
	<li>試料を12μmの厚さに切り、スライドアダプタを使用して専用のLMDスライドに貼り付けます。各スライドは、スライドごとに1つの腎切除セクションを保持するか、スライドごとに最大2つの腎臓生検セクションを保持します。スライドを -80 °C に乾燥剤カートリッジを使用して保管し、密閉したビニール袋の中に保管して、余分な水分がスライドボックス内に蓄積するのを防ぎます。</li>
	<li>各スライドに、標本ID、日付、スライド番号をラベル付けします。</li>
	<li>凍結切断の最初の日から10日以内に標本とスライドを使用してください。</li>
</ol>2. レーザーマイクロディシス
<ol><li>染色の直前に、以下を加えることによってRNaseフリーPBSで10%BSAの抗体ミックス(Ab-Mix)を調製する:FITC-ファロイジンの4 μL、 DAPIの1.5 μL、アレクサフルオール546に直接結合したタム・ホースフォールタンパク質(THP)抗体の2μL、RNase阻害剤の3.3μL、PBS中の10%BSAの89.2 μL(100 μLの体積に達する)。 注:代替抗体はTHP抗体の代わりに使用されてもよい。例えば、2μLのメガリン/LRP2抗体は、アレクサフルオール568に直接結合して、近位細管を標識するために使用することができる。Ab-Mixには、LRP2またはTHP抗体が含まれています(それぞれ、近位細管または太い上昇肢のいずれかを視覚化します)。他の抗体は、ユーザのニーズに応じて検証され得る。</li>
	<li>スライドを氷冷(-20°C)で100%アセトンで1分間洗い、湿度室に移動します。</li>
	<li>RNaseフリーPBSでスライドの上部を30sリピートで洗います。</li>
	<li>RNaseフリーPBSで10%BSAでスライドの上部を30sの繰り返し洗います。</li>
	<li>5分間、Ab-Mixを塗布します。</li>
	<li>RNaseフリーPBSで10%BSAでスライドの上部を30sの繰り返し洗います。</li>
	<li>スライドを5分間空気乾燥し、レーザーマイクロ解剖切断プラットフォームに積み込みます。</li>
	<li>PCR作業に適した回収チューブ(オートクレーブ0.5 mLマイクロ遠心分離チューブ)を取り付け、RNA分離キットから50 μLの抽出バッファーを含みます。</li>
	<li>LMD を続行します。各 LMD セッションは、2 時間以内に完了します。<ol>
<li>顕微鏡カメラを使用して、実行されたプロトコルのアーカイブ目的、トレーニング、品質評価の解剖を検証するために、LMD前後の免疫蛍光画像を収集します。0.5 ~ 1 ng の RNA を得るためには、最低 500,000 μm2 領域が必要です。これは、多くの場合、関心のあるすべてのサブセグメントに十分な量の材料を得るために、最大8 x12 μm厚いセクションを使用する必要があります。</li>
		<li>染色、形態、位置によって関心領域を特定し、40を超えるレーザーパワーを使用してそれらを切除します。 注: 解剖基準は次のとおりです。近位細管はFITC-ファロイジンおよびLRP2標識によって定義される。太い昇順の四肢はTHPラベリングによって定義されます。収集ダクトは核形態(DAPI)および他の染色の欠如によって定義される。糸球体はFITC-ファロイジンおよび形態によって定義される。インタースティジウムは、染色された管状の間の面積として定義される。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2つの12μm断面をLMDスライドに貼り付け、その断面全体を抽出バッファに解剖することで、バルク断面式シグネチャを得ます。</li>
	<li>LMDプロセスが完了したら、収集マイクロ遠心チューブを閉じ、それを激しくフリックして、コンテンツがキャップからチューブの底に移動したことを確認します</li>
	<li>30 sの3,000 x g でチューブを遠心分離します。</li>
	<li>42°Cの水浴で30分間チューブをインキュベートします。</li>
	<li>2分間3,000 x g でチューブを遠心分離します。</li>
	<li>上清を新しい0.5 mLチューブに移し、-80°Cで保管してください。</li>
</ol>3. RNAの単離
注: この RNA 絶縁プロトコルでは、市販の RNA 分離キットからプロトコルを適合させました。製造元のプロトコルは、プロジェクトに設定された品質管理要件を満たすように変更されています。
<ol><li>各RNA精製カラム(PC)に250μLのコンディショルドバッファー(CB)を加え、室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>遠心分離機 16,000 x gで 1 分間すべての PC .</li>
	<li>50 μLの70%エタノール(キットに付属)を組織サンプルでチューブに加えます。上下にピペットを入れ、サンプルをよく混ぜます。渦を出さないで下ろしてください。遠心分離機を使用しないでください。</li>
	<li>100 x g で 2 分間調整された PC と遠心分離機に混合物を移し、16,000 x g で 30 s の遠心分離を迅速に行います (流れを除去するため)。特定のサブセグメントに対して組織サンプルを持つチューブが 1 つ以上ある場合は、この手順を繰り返します。</li>
	<li>100 μL のウォッシュバッファ 1 (WB1) を PC に追加し、遠心分離機を 8,000 x gで 1 分間追加します。</li>
	<li>各サンプルごとに40 μLのDNaseを用意します(RDDバッファの35 μLに5μLのDNaseを追加します)。その後、PCの膜に直接40μLの混合物を加え、室温で15分間インキュベートします。</li>
	<li>PCの膜にWB1の40 μLを加え、8,000 x gで15 sの遠心分離機を加 えます。</li>
	<li>PCの膜に100 μLのウォッシュバッファ2(WB2)を加え、遠心分離機を8,000 x gで1分間加 えます。</li>
	<li>PCの膜にWB2の100 μLを加えて、16,000 x gで2分間遠心分離し、16,000 x gで1分間の遠心分離の直後に加 えます。</li>
	<li>PCを新しい0.5 mLチューブに移します。</li>
	<li>膜に溶出バッファー(EB)の12 μLを加え、室温で7分間インキュベートします。したがって、全ての分化された解剖組織サンプルの最終容積は、サブセグメント当たり12μLである。</li>
	<li>遠心分離 1000 x g で 1 分間、16,000 x gで 2 分間のサンプルを.</li>
	<li>バイオアナライザ分析用に2μLを新しいチューブに移します(凍結融解イベントを防止するため)。</li>
	<li>すべてのチューブを-80 °Cに保管して、さらなる処理の準備が整います。</li>
</ol>4. RNAシーケンシング
<ol><li>商業用バイオアナライザーと少量のRNA測定専用チップを使用して、シーケンシング用の各サンプルを評価します。</li>
	<li>ライブラリの準備とシーケンスの前に次の品質管理(QC)パラメータが必要です:バルクの場合は4 ngより大きく、各サブセグメントの1 ng以上のRNAの量。200ヌクレオチド(DV200)より長い転写物のパーセントは、LMD標本(最適>75%)に対して25%を超える必要があります。</li>
	<li>少量の分解されたRNAを対象とした商用cDNAライブラリ調製キットでライブラリの準備を行います。サプリメントに記載されている市販キットの場合、25% の最小 DV200 と断片化を必要としないオプション 2 を使用することをお勧めします。シーケンス テクノロジによっては、30% 7 など、より高い最小 DV200 しきい値が必要になる場合があります。</li>
	<li>cDNAアダプターとインデックスを追加します。</li>
	<li>磁気ビーズ技術を使用して、RNAseqライブラリを浄化します。</li>
	<li>RNAseqライブラリ増幅工程の前に市販のrRNA除去キットを使用してリボソームcDNAを枯渇させます。</li>
	<li>2 ng/μL cDNAライブラリ濃度で磁気ビーズ技術を使用して、最終的なRNAseqライブラリを精製します。</li>
	<li>バルク用に 3,000 万読み取り/サンプル、サブセグメントセクションの場合は 1 億読み取り/サンプルを使用して、商業シーケンシング システムで 75 bp ペアエンドの RNA シーケンシングを実行します。</li>
	<li>バッチ効果の制御を可能にするために、シーケンシングの実行ごとにリファレンスRNA(25 μg)を使用してください。リファレンスRNAの初期濃度は1μg/μLで、シーケンシングで使用される最終濃度は25 ng/μLです。</li>
	<li>FastQC アプリケーションを利用してデータ解析を実行し、シーケンシング、遺伝子間およびミトコンドリア読み取りの品質を評価し、遺伝子に起因する読み取りを決定します。</li>
	<li>アライメントには統合ゲノミクスビューア(IGV)を使用し、トランスクリプト発現測定にはedgeR/rbamtoolsを使用します。</li>
	<li>100,000 読み取りより少ないサンプルを削除します。位数は、ユーザー定義のしきい値で低く発現した遺伝子を除外した後、データセット内の生の読み取りを正規化します。</li>
	<li>式を、他のすべてのサブセグメントおよび log2 変換の平均に対する対象サブセグメントの比率として定量化します。同じ遺伝子の相対発現は、サブセグメントとサンプル間で比較され得る。しかし、遺伝子とRNA種間の分解の可能性により、2つの異なる遺伝子間の相対的な発現を比較することは理想的ではありません。</li>
	<li>各ネフロンサブセグメントに固有のメーカーのセットの遺伝子発現を比較するために濃縮分析を行い、参照RNAサンプルはバッチ間で比較されます。R 値が 0.9 を超える平均式の標準偏差の 1 以内のバッチ効果は許容可能と見なされます。バッチ効果スコアを高くする場合は、追加の正規化が必要です。受け入れられたバッチ効果から逸脱した実行には、フラグを設定できます。Q30 は、シーケンス実行ごとに 90%以上にする必要があります。</li>
</ol>

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

LMDベースのトランスクリプトミクスは、組織内の特定の領域に遺伝子発現を固定する有用な技術である。腎臓におけるこの技術とその潜在的な応用の基礎は、前に説明された8.しかしながら、最適化、近代化、蛍光法解解の合理化は、特に下流RNAシーケンシングのための高精度解離を目的とすることは、あまりユビキタスではない。この方法論は組織内に空間的に接地され?...

組織標本の研究における技術の進歩は、様々な臓器における健康と病気の状態の理解を改善しました。このような進歩は、病理学が限られた領域または特定の細胞タイプで始まることができるが、臓器全体に重要な意味を持つことを強調している。したがって、現在の個別化医療の時代において、細胞レベルと地域レベルの両方で生物学を理解することが重要であり、世界的に1.これは、病理学的ストレスを開始および/または応答する様々な特殊な細胞および構造で構成される腎臓において特に当てはまる。様々なタイプのヒト腎臓病の病因はまだよく分かっていない。ヒト腎臓における特定の管状のセグメント、構造、または間質の領域における遺伝子発現の変化を研究する方法論を生み出すと、疾患の病因を知らせることができる領域固有の変化を発見する能力が高まる。
ヒト腎臓生検検は限られた貴重な資源です。したがって、腎臓組織のトランスクリプトミクスを問い合わせた技術は、組織を減態するために最適化されるべきである。細胞および地域レベルでのトランスクリプトミクスを研究するために利用可能な方法は、単一細胞RNAシーケンシング(scRNaseq)、単一核RNaseq(snRNaseq)、その場空間ハイブリダイゼーション、およびレーザーマイクロダイスセクション(LMD)を含む。後者は、下流RNAシーケンシングおよび分析2、3、4、5のために、組織切片内の対象となる領域または構造を正確に分離するために適しています。LMDは、解剖中に蛍光ベースのイメージングを使用して検証されたマーカーに基づいて、特定の細胞タイプまたは構造の同定に頼るために採用することができる。
レーザー顕微鏡解剖支援地域転写術のユニークな特徴には、1)細胞および構造の空間的文脈の保全が含まれ、細胞が組織学的ではなく発現によって同定される単一細胞技術を補完する。抗体マーカーは発現シグネチャを定義するため、2)この技術は他のイメージング技術に情報を提供し、知らされる。3)マーカーが疾患で変化した場合でも構造を識別する能力;4)約20,000遺伝子における低発現転写物の検出。5)顕著な組織経済。この技術は、十分なRNA取得に必要なコアの厚さが100μm未満の腎臓生検に対してスケーラブルであり、大規模なリポジトリまたは学術センター6で一般的に利用可能なアーカイブされた凍結組織の使用を可能にする。
その後の研究では、ヒト腎臓組織で使用するための新しい急速蛍光染色プロトコルで最適化された、地域およびバルクトランスクリプトミクス技術を詳細に記述します。このアプローチは、凝集した管間質の表現とは対照的に、インタースティジウムおよびネフロンサブセグメントに対して別々の発現データを提供するため、従来の LMD 探索を改善します。厳格かつ再現性を確保するために実施される品質保証と管理対策が含まれています。このプロトコルは、細胞および関心のある領域の可視化を可能にし、これらの孤立した領域からのRNAの満足のいく獲得をもたらし、下流RNAシーケンシングを可能にする。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

ヒト腎臓組織の遺伝子発現解析は、恒常性および疾患病態生理を理解する重要なツールである。この技術の解像度と深さを高め、組織内の細胞のレベルにそれを拡張することが必要です。単一核および単一細胞RNAシーケンシングの使用は広く普及しているが、組織解離から得られた細胞の発現シグネチャは空間的文脈を維持しない。特定の蛍光マーカーに基づくレーザーマイクロディション(LMD)は、既知の局在化を伴う特定の構造および対象細胞群の単離を可能にし、それによって腎臓組織における空間的に固定されたトランスクリプトーミックシグネチャの取得を可能にする。迅速な蛍光ベースの染色に導かれたLMD方法論を最適化し、ヒト腎臓内の5つの異なるコンパートメントを分離し、その後のRNAシーケンシングを貴重なヒト腎臓組織標本から行います。また、収集した検体の妥当性の評価を可能にする品質管理パラメータも提示します。この原稿で概説されているワークフローは、高い信頼を持ってサブセグメントの転写シグネチャを分離するこのアプローチの実現可能性を示しています。ここで提示される方法論的アプローチは、関連する抗体マーカーの置換を伴う他の組織タイプにも適用され得る。

サンプル
9つの基準腎切除術(インディアナ大学で得られた3つの標本と腎臓精密医療プロジェクトを通じて得られた6つの標本)からのデータを提示し、腎臓腎球体のセグメントおよび間質領域を分離する急速な蛍光染色法を利用する。このプロセスで利用されたセクションは、死亡した腎臓ドナーまたは影響を受けない腫瘍腎摘出から得られた。これらのサン?...

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Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

糸球体、近頭尿細管、太い上昇肢、集結管およびインタースティジウムを含むヒト腎臓のサブセグメントのレーザーマイクロディシセクションのプロトコルについて述べている。次いで、RNAを得られたコンパートメントから単離し、RNAシーケンシングを行い、各サブセグメント内のトランスクリプトームシグネチャの変化を決定する。

ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

application-laser-microdissection-to-uncover-regional-transcriptomics

Research

JoVE Journal

Biology

3.8K ビュー.  Indiana University School of Medicine. 糸球体、近頭尿細管、太い上昇肢、集結管およびインタースティジウムを含むヒト腎臓のサブセグメントのレーザーマイクロディシセクションのプロトコルについて述べている。次いで、RNAを得られたコンパートメントから単離し、RNAシーケンシングを行い、各サブセグメント内のトランスクリプトームシグネチャの変化を決定する。

ビデオ: Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

哺乳動物の組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

生物学

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

から細胞のサブセットの遺伝子発現プロファイリングへの応用レーザーマイクロダイセクションショウジョウバエウィングディスク

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

マウス単離された灌流腎臓テクニック

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

植物における空間的および時間的組織特異的な遺伝子発現解析のためのレーザー捕捉マイクロ解離RNAシーケンシング

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high efficiency. Normal kidney tubuloids recapitulate many aspects of their tissue of origin. They represent distinct nephron segments - most notably of the proximal tubule, loop of Henle, distal tubules, and collecting duct - and can be used to study normal kidney physiology. Furthermore, tubuloid technology facilitates disease modeling, e.g., for infectious diseases as well as for cancer. Obtaining kidney epithelial cells for tubuloid generation is, however, dependent on leftover surgical material (such as partial) nephrectomies) or needle biopsies. The ability to grow tubuloids from urine would provide an alternative, less invasive source of healthy kidney epithelial cells. It has been previously shown that tubuloid cultures can be successfully generated from only a few milliliters of freshly collected urine. This article describes the protocols to generate and propagate ASC-derived human kidney tubuloid cultures from tissue and urine samples.

Human kidney tubuloid cultures represent a valuable in vitro model to study kidney physiology and disease. Tubuloids can be established from kidney tissue (healthy and diseased) as well as urine, the latter representing an easily obtainable and less invasive source of research material.

組織と尿からのヒト腎臓結管状突起の生成

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

種にとらわれない単一組織アプリケーションのためのレーザーマイクロダイセクション

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...